Ферменти. Характеристика ґрунтових ферментів. Як працюють в організмі

Поняття про ферменти

Ферментами (ензимами)називають розчинні або пов'язані з мембранами білки, наділені каталітичної активністю. (Крім білків каталітичну активністьв організмі можуть проявляти деякі РНК (рибозими) і антитіла (абзими), однак вони в тисячі разів менш ефективні, ніж ферменти.) Ці назви походять від латинського «fermentatio» - бродіння і грецького «en zym» - всередині закваски. Вони нагадують про перші джерелах ферментів. Біохімії, яка вивчає ферменти, називається ензимологія. На схемах і в рівняннях реакцій молекули ферментів позначають - Е. Речовини, перетворення яких каталізують ферменти, називають субстратами (S). продуктиензиматичною реакцііобозначают - Р. Тому що ферменти є білками, їх отримують в гомогенному вигляді тими ж способами, що і інші білки. Для ферментів характерні фізико-хімічні властивості, властиві білкам.

Відмінність ферментів від неорганічних каталізаторів:

а) прискорюють реакції значно ефективніше;

б) наділені високою специфічністю дії;

в) піддаються регуляції в фізіологічних умовах;

г) діють в м'яких умовах.

будова ферментів

Ферментами можуть бути як прості, так і складні (кон'юговані) білки, до складу яких можуть входити ліпіди, вуглеводи, іони металів, азотисті основи, похідні вітамінів. В організмі ферменти можуть функціонувати як в розчинній стані, так і у вигляді нерозчинних комплексів або входити до складу біологічних мембран.

Відмінною особливістю ферментів є наявність активного центру. Активний центр -це унікальна комбінація зближених в просторі амінокислотних залишків, яка забезпечує:

а) впізнавання молекули субстрату,

б) зв'язування субстрату з ферментом,

в) здійснення каталітичного перетворення (в разі складного ферменту в акті каталізу також бере участь кофермент, що входить до складу активного центру).

Активний центр виникає в той момент, коли білок згортається і приймає свою нативну (активну) конформацию. Структура активного центру може змінюватися при взаємодії з субстратом. За образним висловом Д. Кошланда субстрат підходить до активного центру як рука до рукавичці.

Одна молекула ферменту, особливо якщо вона складається з декількох субодиниць, може містити більше одного активного центру.

В активному центрі є дві ділянки. Перша ділянка відповідає за впізнавання і зв'язування субстрату. Він називається субстрат-зв'язуючим ділянкою або якірної майданчиком. Друга ділянка називається каталітичним, в його склад входять амінокислотні залишки, які беруть участь в акті каталізу.

Ферменти являють білки, сильно розрізняються за молекулярною масою і складності будови. Прикладом ферменту з невеликою молекулою є рибонуклеаза, що складається з однієї субодиниці з молекулярною масою 13700 Дa. (У рибонуклеази визначена амінокислотна послідовність. У 1969 р рибонуклеаза була синтезована в лабораторії Б.Мерріфілда в Нью-Йорку.) Багато ферменти складаються з декількох субодиниць, наприклад, лактатдегидрогеназа складається з чотирьох субодиниць двох видів. До теперішнього часу відомо кілька мультиферментних комплексів, що складаються з десятків різних субодиниць і декількох типів коферментів. Наприклад, піруватдегідрогеназний комплекс складається з 60 субодиниць трьох типів і п'яти типів кофакторов. Молекулярна маса такого комплексу становить 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Дa в залежності від джерела ферменту. Молекула ферменту може бути менше, ніж молекула субстрату. Наприклад: молекули ферментів амілази і рибонуклеази менше, ніж молекули їх субстратів - крохмалю і РНК.

Білкова частина складних ферментів каталитически неактивна і називається апоферментом. Зв'язування апофермента з небілковим компонентом призводить до утворення каталітично активного ферменту (холоферменту):

Багато ферменти містять в своєму складі іон металу, який може виконувати різні функції:

а) брати участь в зв'язуванні субстрату і процесі його каталітичного перетворення;

б) сприяти приєднанню коферменту до молекули ферменту;

в) стабілізувати третинну структуру ферменту (наприклад Са 2+ в амілази);

г) зв'язуючись з субстратом, утворювати істинний субстрат, на який діє фермент.

Багато коферменти є похідними вітамінів, тому порушення обміну речовин при вітамінної недостатності обумовлено зниженням активності певних ферментів.

Деякі ферменти поряд з активним центром містять аллостерічеський (регуляторний) центр -ділянку білкової глобули, поза активного центру, де можуть зв'язуватися речовини, що регулюють ферментативну активність. Ці речовини називають аллостеріческого ефекторами (аллостеріческого активаторами або інгібіторами). В результаті зв'язування ефектора з аллостерическим центром відбувається зміна структури білка, що приводить до зміни просторового розташування амінокислотних залишків в активному центрі та, в результаті, до зміни ферментативної активності.

Ферменти, що зустрічаються в одному організмі і каталізують одну і ту ж хімічну реакцію, Але з різною первинною структурою білка, називаються ізоферментами. Ферменти відрізняються один від одного за такими фізико-хімічними властивостями, Як молекулярна маса, термостабільність, Субстратна специфічність, електрофоретична рухливість. Природа появи изоферментов різноманітна, але частіше за все обумовлена ​​відмінностями в структурі генів, що кодують ці ізоферменти або їх субодиниці. Наприклад, фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ), що каталізує оборотну реакцію окислення лактату до пірувату, має чотири субодиниці двох типів М і Н, комбінація цих субодиниць лежить в основі формування п'яти ізоферментів ЛДГ (рис.1). Для діагностики захворювань серця і печінки необхідно дослідження ізоферментного спектра ЛДГ в сироватці крові, оскільки ЛДГ 1 і ЛДГ 2 активні в серцевому м'язі і нирках, а ЛДГ 4 і ЛДГ 5 - а скелетних м'язах і печінці.

Рис.1 Будова різних ізоферментів ЛДГ.

Вимірювання ферментативної активності

Визначення активності ферментів здійснюється шляхом вимірювання швидкості каталізуються реакцій. Швидкість ферментативних реакцій вимірюють по убутку концентрації субстрату або збільшення концентрації продукту за одиницю часу:

v = -ΔС S / Δτ, v = ΔC P / Δτ,

де ΔС S- зміна молярної концентрації субстрату (моль / л),

ΔC P- зміна молярної концентрації продукту реакції (моль / л),

Δτ - зміна часу (хв, сек).

Кінетичні дослідження бажано проводити при насичує концентрації субстрату, в іншому випадку фермент не матиме можливість проявити максимальну активність.

Одиниці активності ферментів:

Міжнародна одиниця ферменту (U)- це така кількість ферменту, яке каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хвилину при температурі 25 о С і оптимальному рН середовища.

В системі СІ одиницею ферменту є катав (кат)це така кількість ферменту, яке каталізує перетворення одного мольсубстрата за 1 секунду. Неважко підрахувати, що:

1 U = (1 * 10 -6 М) / 60 з = 1,67 * 10 -8 М з-1 = 1, 67 * 10 -8 кат = 16,7 нкат.

часто визначають питому активністьпрепаратів ферменту розподілом активності навішування препарату ферменту, вираженої в (U), на масу навішування в міліграмах:

А уд = U / маса препарату (мг)

При очищенні ферментів питома активність збільшується. За зростанням питомої активності можна судити про ефективність стадій очищення та чистоті ферментного препарату.

Для оцінки активності високоочищених, гомогенних препаратів ферментів розподілом числа міжнародних одиниць (U) ферменту в зразку на кількість речовини ферменту (мкмоль) в цьому зразку розраховують молярну активність(число обертів). за фізичним змістоммолярна активність - це число молекул субстрату, що піддаються перетворенню на одній молекулі ферменту за 1 хвилину або за 1секунду. Наприклад: для уреази, прискорює гідроліз сечовини, молярна активність становить 30000, трипсину - 102, глюкозоксидаза - 17000 циклів в секунду.

властивості ферментів

4.1. Механізм дії.Ферменти зміщують рівновагу каталізуються реакцій в бік утворення продуктів, таким чином, константа рівноваги реакції залишається постійною. Як і всі каталізатори, ферменти лише зменшують час досягнення цієї рівноваги. У більшості випадків ферменти прискорюють реакції в 10 7 - 10 14 разів. В основі ефективності ферментативного каталізу лежить сильне зниження енергії активації реакції за рахунок перетворення субстрату в продукт через перехідні стани.

4.2. специфічність дії. Специфічність зв'язування з субстратом і шляхи протікання ферментативної реакції визначаються апоферментом. Специфічність дії ферментів визначає спрямований обмін речовин в організмі.

Про ферментах кажуть, що вони мають вузьку субстратне специфічність, Якщо вони діють на дуже невелике коло субстратів. Іноді можна говорити про абсолютної субстратної специфічності,наприклад, каталаза каталізує тільки одну реакцію - розкладання пероксиду водню:

Для більшості ферментів характерна відносна (широка, групова) Субстратна специфічність, Коли вони каталізують групу однотипних реакцій. Наприклад, алкогольдегидрогеназа каталізує перетворення спиртів в альдегіди, причому в якості субстратів можуть виступати метанол, етанол, пропанол і інші спирти. Цікавим є той факт, що алкогольдегидрогеназа може окисляти і нелінійні спирти, а також спиртову групу, що входить до складу складних молекул, зокрема, цей фермент може каталізувати перетворення ретинолу в ретиналь. Природно, ферменти, наділені широкою субстратної специфічністю, каталізують перетворення субстратів з різною ефективністю.

Ферменти наділені також стереохимической специфічністю: Їх активний центр розпізнає молекули субстратів по просторової конфігурації. Наприклад, оксидази L-амінокислот активні тільки щодо L-амінокислот і абсолютно не діють на їх D-аналоги. Для окисного дезамінування D-амінокислот в живих організмах є оксидази D-амінокислот, що не діють на L-амінокислоти. Саме здатність активного центру зв'язуватися з певними стереоізомерами субстрату лежить в основі функціонування таких ферментів, як рацемази, які перетворюють одні стереоізомери в інші.

Специфічність шляхів перетворенняполягає в тому, що один субстрат під дією різних ферментів може перетворюватися в продукти, що розрізняються за структурою та ролі в метаболізмі.

Наведемо приклад: оксидази L-амінокислотдіють на L-амінокислоти, перетворюючи їх в альфа-кетокислот з утворенням аміаку і пероксиду водню.

Декарбоксилази L-амінокислотзв'язуються з тими ж субстратами, але каталізують іншу реакцію: декарбоксилирование з утворенням біогенних амінів і виділенням вуглекислого газу.

Ще одним прикладом є можливість перетворення глюкозо-6 фосфату під дією різних ферментів, по одному з можливих метаболічних шляхів:

4.3. термолабильность .

Як і багато білків, при підвищенні температури ферменти піддаються термічній денатурації, що призводить до порушення нативної конформації ферменту і зміни структури активного центру. Ферменти ссавців починають помітно денатурувати при температурах вище 40 о С.

У зв'язку з вищесказаним, ферментні препарати бажано зберігати при знижених температурах. Одним з кращих шляхів збереження ферментів є їх лиофилизация (висушування при температурі нижче -70 ° С у вакуумі), переведення в частково денатуровані стан за допомогою солей амонію і приміщення в холодильник.

4.4. Залежність швидкості реакції від температури.Швидкість ферментативних реакцій, як і будь-яких хімічних реакцій, залежить від температури. При підвищенні температури на 10 о С швидкість реакції збільшується в 2-4 рази згідно з правилом Вант-Гоффа. Однак при температурах вище 40 ° С істотною стає денатурація ферментів, що призводить до зменшення сумарної активності (рис. 2):

Мал. 2. Залежність швидкості ферментативної реакції від температури.

4.5. Залежність швидкості реакції від рН.Залежність швидкості ферментативної реакції від рН має колоколообразний вид (рис. 3). Значення рН, при яких спостерігається найбільш висока швидкість ферментативної реакції, називають оптимальними (рН-оптимум). Характер кривих і значення рН-оптимуму залежить від природи заряджених груп субстрату і заряджених груп ферменту (особливо тих, які входять в активний центр). Оптимум рН для більшості ферментів лежить в межах від 6,0 до 8,0 (рис. 3).

Мал. 3. Залежність швидкості ферментативної реакції від рН.

Однак, є й винятки, наприклад, пепсин найбільш активний при рН 1,5 - 2,0, а лужна фосфатаза при рН 10,0 - 10,5 (рис. 4)

Мал. 4. Залежності швидкості ферментативної реакції (v) від рН середовища.

При екстремальних (дуже низьких або дуже високих) значеннях рН відбувається порушення третинної структури молекули ферменту, що приводить до втрати ферментативної активності.

Схожа інформація.

Поняття активності ферменту

У повсякденному біохімічної практиці практично не оцінюється кількість ферменту, а тільки його активність. Активність - більш широке поняття, ніж кількість. Вона має на увазі в першу чергу результат реакції, а саме спад субстрату або накопичення продукту. Природно, при цьому не можна ігнорувати час, яке пропрацював фермент і число молекул ферменту. Але так як число молекул ферменту підрахувати зазвичай нереально, то використовують кількість біологічного матеріалу, що містить фермент (обсяг або масу).

Таким чином при визначенні активності ферментів потрібно одночасно враховувати три змінні:

• маса отриманого продукту або зниклого субстрату;
• час, витрачений на реакцію;
• кількість ферменту, але насправді масу або обсяг біологічного матеріалу, що містить фермент.

Для розуміння співвідношень зазначених факторів наочним і простим прикладом може слугувати будівництво двох будинків. Будинки прирівняємо до продукту реакції, робочі - це ферменти, бригада нехай відповідає обсягу біологічного матеріалу. Отже, завдання з 3-го класу:

1. На будівництві одного будинку працювала бригада з 10 чоловік, іншого такого ж будівлі - бригада з 5 чоловік. Будівництво закінчено одночасно і в повному обсязі. Де вище активність робочих?
2. На будівництві одного будинку з 3 поверхів трудилася бригада з 10 чоловік, іншої будівлі з 12 поверхів - бригада теж з 10 чоловік. Будівництво закінчено одночасно і в повному обсязі. Де вище активність робочих?
3. На будівництві одного будинку з 5 поверхів трудилася бригада з 10 чоловік, іншого такого ж будівлі - бригада теж з 10 чоловік. Будівництво першої будівлі зайняло 20 днів, друге побудовано за 10 днів. Де вище активність робочих?

Основи кількісного визначення активності ферментів

1. Активність ферменту виражається в швидкості накопичення продукту або швидкості убутку субстрату в перерахунку на кількість матеріалу, що містить фермент.

У практиці зазвичай використовують:

• одиниці кількості речовини - моль (і його похідні ммоль, мкмоль), грам (кг, мг),
• одиниці часу - хвилина, годину, секунда,
• одиниці маси або обсягу - грам (кг, мг), літр (мл).

Активно використовуються і інші похідні - катав (моль / с), міжнародна одиниця активності (МЕ, Unit) відповідає мкмоль / хв.

Таким чином, активність ферменту може виражатися, наприклад, в ммоль / с × л, г / год × л, МО / л, кат / мл і т. Д.

Наприклад, відомо,

2. Створення стандартних умов, щоб можна було порівнювати результати, отримані в різних лабораторіях - оптимальна рН і фіксована температура, наприклад, 25 ° С або 37 ° С, дотримання часу інкубації субстрату з ферментом.

ферментативна активністьгрунтів [від лат. Fermentum - закваска]-здатність грунту проявляти каталітична дія на процеси перетворення екзогенних і власних органічних і мінеральних сполук завдяки наявним в ній ферментам. Характеризуючи ферментативну активність грунтів, мають на увазі сумарний показник активності. Ферментативна активність різних грунтів неоднакова і пов'язана з їх генетичними особливостями і комплексом взаємодіючих екологічних чинників. Рівень ферментативної активності грунтів визначається активністю різних ферментів (інвертази, протеаз, уреази, дегидрогеназ, каталази, фосфатаз), яка виражається кількістю розкладеного субстрату за одиницю часу на 1 г грунту.

Биокаталитических активність грунтів залежить від ступеня обогащенности їх мікроорганізмами і від типу грунтів. Активність ферментів змінюється по генетичним обріїв, які відрізняються за змістом гумусу, типам реакцій, окисно-відновним потенціалом та іншими показниками за профілем.

У цілинних лісових ґрунтах інтенсивність ферментативних реакцій в основному визначають горизонти лісової підстилки, а в орних - орні шари. Всі біологічно менш активні генетичні горизонти, що знаходяться під горизонтами А чи Ап, мають низьку активність ферментів. Активність їх незначно зростає при окультурення грунтів. Після освоєння лісових грунтів під ріллю ферментативна активність утвореного орного горизонту в порівнянні з лісовою підстилкою різко знижується, але в міру його окультурення підвищується і в сильно окультурених грунтах наближається або перевищує показники лісової підстилки.

Ферментативна активність відображає стан родючості грунтів і внутрішні зміни, що відбуваються при сільськогосподарському використанні і підвищенні рівня культури землеробства. Ці зміни виявляються як при залученні цілинних і лісових грунтів в культуру, так і при різних прийомах їх використання.

По всій Білорусі в орних грунтах щорічно втрачається до 0,9 т / га гумусу. В результаті ерозії щорічно безповоротно несеться з полів 0,57 т / га гумусу. Причинами дегумификации грунтів є посилення мінералізації ґрунтового органічної речовини, Відставання процесів новоутворення гумусу від мінералізації в зв'язку з недостатнім надходженням в грунт органічних добрив і зниження ферментативної активності ґрунту.

Біохімічні перетворення органічної речовини грунту відбуваються в результаті мікробіологічної діяльності під впливом ферментів. ферментативний активність грунт мікроорганізм

Особливу роль відіграють ферменти в життєдіяльності тварин, рослин і мікроорганізмів. Грунтові ферменти беруть участь при розпаді рослинних, тварин і мікробних залишків, а також синтезі гумусу. В результаті живильні речовини з важко засвоюваних сполук переходять в легко доступні форми для рослин і мікроорганізмів. Ферменти відрізняються високою активністю, суворої специфічністю дії і великою залежністю від різних умовзовнішнього середовища. Завдяки каталітичної функції вони забезпечують швидке протікання в організмі або поза його величезного числа хімічних реакцій.

Спільно з іншими критеріями ферментативна активність грунтів може служити надійним діагностичним показником для з'ясування ступеня окультуреності грунтів. В результаті досліджень 4, с. 91 встановлено залежність між активністю мікробіологічних і ферментативних процесів і проведенням заходів, що підвищують родючість грунтів. Обробка грунтів, внесення добрив істотно змінюють екологічну обстановку розвитку мікроорганізмів.

В даний час в біологічних об'єктах виявлено кілька тисяч індивідуальних ферментів, а кілька сотень з них виділено і вивчено. Відомо що жива клітинаможе містити до 1000 різних ферментів, кожен з яких прискорює ту чи іншу хімічну реакцію.

Інтерес до застосування ферментів викликаний ще й тим, що постійно зростають вимоги щодо збільшення безпеки технологічних процесів. Присутня в усіх біологічних системах, будучи одночасно продуктами і інструментами цих систем, ферменти синтезуються і функціонують при фізіологічних умовах (pH, температура, тиск, присутність неорганічних іонів), після чого легко виводяться, піддаючись руйнування до амінокислот. Як продукти, так і відходи більшості процесів, що протікають за участю ферментів, є нетоксичними і легко руйнують. Крім того, у багатьох випадках, ферменти, які використовуються в промисловості, отримують екологічно безпечним шляхом. Від небіологічних каталізаторів ферменти відрізняють не тільки безпеку і підвищена здатність до біодеградації, а й специфічність дії, м'які умови протікання реакцій і висока ефективність. Ефективність і специфічність дії ферментів дозволяє отримувати цільові продукти з високим виходом, що робить використання ферментів в промисловості економічно вигідним. Застосування ферментів сприяє скороченню витрати води та енергії в технологічних процесах, зменшує викиди в атмосферу CO2, знижує ризик забруднення довкілляпобічними продуктами технологічних циклів.

Застосуванням передової агротехніки можна змінювати в сприятливу сторону мікробіологічні процеси не тільки орного, а й підорного шарів грунту.

За безпосередньої участі позаклітинних ферментів відбувається розкладання органічних сполукгрунту. Так, протеолітичні ферменти розщеплюють білкові речовини і до амінокислот.

Уреаза розкладає сечовину до СО2 і NH3. Утворений аміак і амонійні солі служать джерелом азотного живлення рослин і мікроорганізмів.

Інвертаза і амілаза беруть участь в розщепленні вуглеводів. Ферменти групи фосфатів розкладають фосфорорганічні сполуки грунту і грають важливу роль в фосфатному режимі останньої.

Для характеристики загальної ферментативної активності ґрунту зазвичай використовують найбільш поширені ферменти, властиві переважній більшості грунтової мікрофлори - инвертазу, каталазу, протеазу та інші.

В умовах нашої республіки проводилося чимало досліджень 16, с. 115 з вивчення зміни рівня родючості і ферментативної активності грунтів при антропогенному впливі, проте отримані дані не дають вичерпної відповіді на характер змін через складність зіставлення результатів на увазі відмінності умов проведення дослідів і методик досліджень.

У зв'язку з цим пошук оптимального вирішення проблеми поліпшення гумусного стану ґрунту і її ферментативної активності в конкретних грунтово-кліматичних умовах на основі розробки ресурсозберігаючих прийомів основного обробітку почвиё застосування грунтозахисних сівозмін, що сприяють збереженню структури, запобігання переущільнення грунту і поліпшення їх якісного стану та відновлення родючості грунтів при мінімальних витратах, саме на часі.

Дослідження по визначенню ферментативної активності МКД на основі різних бактерій проводилися в чотири етапи. Для дослідження були відібрані зразки МКД на основі монокультур МКД-В (Bifidobacter bifidum longum),МКД-S ( Streptococcus termophilus), МКД-P (Propionobacterium acidi-propionicum),МКД-L (Lactobacillus acidophilus).

Мета досліджень - визначення здатності у пробіотичних мікроорганізмів, що входять до складу МКД, синтезувати ферменти.

На першому етапіпо ГОСТ 20264.4-89 «Препарати ферментні. Метод визначення амилолитической активності »у всіх зразках МКД методом Айсон визначалася сумарна амилолитическая активність. Метод Ансона заснований на гідролізі крохмалю ферментно-амілолітична комплексом до декстринів різної молекулярної маси.

На другому етапіпо ГОСТ 20264.2-88 «Препарати ферментні. Методи визначення протеолітичної активності »визначалася сумарна протеолітична активність (ПА) в досліджуваних зразках. Метод заснований на гідролізі білка казеїнату натрію ферментним комплексом при pH-7,2. Для визначення ПА нейтральної протеази 0-10 од / мл перевірені мінімальні розведення. Кисла протеаза визначалася при pH-5,5, при якій проходить гідроліз білка.

На третьому етапіпо ТУ9291-008-13684916-05 у всіх представлених зразках МКД визначалася загальна ЦЕЛЮЛОЗОЛІТИЧНИХ активність (ЦА). Методика визначення целюлази заснована на визначенні відновлюють цукрів в результаті гідролізу целюлази хроматографічного паперу під дією ферменту. Метод рекомендований міжнародною комісією ІЮПАК по біотехнології в якості основного тесту на целлюлазной активність. За одиницю ефективності целюлази приймають таку кількість ферменту, яке при дії на хроматографічний папір при 50 ° С і pH 4,8 утворює 1 ммоль відновлюють цукрів в 1 хв. Як правило, активність виражається в одиницях на мілілітр.

останнім, четвертим, етапомбуло визначення активності ліпази (ЛА). Метод визначення ліпази за методикою Скермана заснований на титруванні лугом жирних кислот, що утворилися під дією ліпази, при використанні в якості субстрату оливкового масла. При визначенні ліпази використовувалася реакційна суміш, що складається з 6,5 мл 1/15 М фосфатно-цітрат- ного буфера, 2,5 мл емульсії оливкової олії в 1% -му розчині полівінілового спирту в співвідношенні 2: 3 і 1 мл фільтрату культуральної рідини .

Дослідження МКД на основі різних мікроорганізмів-пробіотиків показали, що всі досліджувані МКД містять одну або кілька груп ферментів (табл. 8). Так, МКД-В показала наявність всіх досліджуваних груп ферментів. МКД-Р містить в своєму складі три групи ферментів: амилолитические, протеолітичні, целлюлозолитические. У МКД-L виявлені також три групи ферментів: протеолітичні, целлюлозолитические і липолитические, слабо виражена амилолитическая група. МКД-S має в своєму складі дві групи ферментів: протеолитическую і целюлозолітичну, амилолитическая і ліполітичних активність виражені слабо.

Таблиця 8

Ферментативна активність МКД, од / мл

Аналізуючи дані, отримані в результаті дослідження ферментативної активності МКД, можна відзначити, що всі досліджувані МКД мають високий ступіньактивності целюлази - від 64,46 (МКД-Р) до 72,4 од / мл (МКД-L).

МКД-S і МКД-В мають однакову активність целюлази - 66,7 од / мл.

Всі досліджувані нами МКД містять кислу протеазу, в якій гідроліз білка здійснюється при pH-5,5. Найбільша активність протеази виявлена ​​в МКД-Р - 7,5 од / мл, найменша - в МКД-L (1,0 од / мл). МКД-В має значення активності протеази 2,0, МКД-S - 2,5 од / мл.

Активність ліпази визначена в МКД-L - 1,4 і в МКД-В - 12,6 од / мл. У МКД-S і МКД-Р фермент ліпаза не розпізнаний.

Амілолітична активність виявлена ​​в МКД-В - 11,2 і в МКД-Р - 9,4 од / мл.

На рис. 1 ^ 1 графічно представлені значення ферментативної активності МКД.

Мал. 1.

Мал. 2.

Мал. 3.

Мал. 4.

Результати дослідження ферментативної активності МКД на основі різних бактерій узгоджуються з літературними даними про те, що бактерії-пробіон- ти володіють ферментативною активністю. Наші дослідження виявили лідируючі ферментні властивості біфідобактерій у складі МКД в порівнянні з іншими досліджуваними мікроорганізмами. Різні штами біфідобактерій складають, за деякими даними, до 90% представників нормофлори кишечника птиці. Біфідобактерії знаходяться у всіх відділах кишечника.

Синтезовані ними ферментні групи беруть участь у всіх ферментних процесах при перетворенню поживних речовин корму в шлунково-кишковому тракті. На думку А. І. Хавкіна (2003), біфідобактерії беруть активну участь в процесах ензиматичного пререваріванія кормів, посилюючи гідроліз протеїнів, зброджують вуглеводи, обмилюють жири, розчиняють клітковину Всі досліджувані нами бактерії в складі МКД показали певну ступінь ферментативної активності. Отримані дані свідчать про специфічність рівня і спектра вироблених ферментних груп в залежності від приналежності мікроорганізмів до певних видів і умов життєдіяльності. Ці дані, в сукупності з іншими характеристиками, повинні враховуватися при розробці різних рекомендацій щодо застосування тих чи інших видів пробіотичних кормових добавок.

Ферментативна активність мікроорганізмів багата і різноманітна. По ній можна встановити не тільки видову і типову приналежність мікроба, але і визначити його варіанти (так звані біовари). Розглянемо основні ферментативні властивості і їх якісне визначення.

розщеплення вуглеводів(Сахаролитической активність), т. Е. Здатність розщеплювати цукру і багатоатомні спирти з утворенням кислоти або кислоти і газу, вивчають на середовищах Гісса, які містять той чи інший вуглевод і індикатор. Під дією утворюється при розщепленні вуглеводу кислоти індикатор змінює забарвлення середовища. Тому ці середовища названі "строкатий ряд". Мікроби, що не ферментують даний вуглевод, ростуть на середовищі, не змінюючи її. Наявність газу встановлюють за освітою бульбашок в середовищах з агаром або по скупченню його в "поплавці" на рідких середовищах. "Поплавок" - вузька скляна трубочка з запаяним кінцем, зверненим вгору, яку до стерилізації поміщають в пробірку з середовищем (рис. 18).

Мал. 18. Вивчення сахаролитической активності мікроорганізмів. I - "строкатий ряд": а - рідке середовище з вуглеводами і індикатором Андреде; б - напіврідка середовище з індикатором ВР: 1 - мікроорганізми не ферментують вуглевод; 2 - мікроорганізми ферментують вуглевод з утворенням кислоти; 3 - мікроорганізми ферментують вуглевод з утворенням кислоти і газу; II - колонії мікроорганізмів, які не розкладають (безбарвні) і розкладають лактозу (фіолетові на середовищі ЕМС - зліва, червоні на середовищі Ендо - праворуч)

Крім того, сахаролитической активність вивчають на середовищах Ендо, ЕМС, Плоскірєва. Мікроорганізми, зброджуючи до кислоти знаходиться в цих середовищах молочний цукор (лактозу), утворюють забарвлені колонії - кислота змінює колір наявного в середовищі індикатора. Колонії мікробів, які не ферментують лактозу, безбарвні (див. Рис. 18).

Молоко при зростанні мікробів, сбраживающих лактозу, згортається.

При зростанні мікроорганізмів, що утворюють амілазу, на середовищах з розчинною крохмалем відбувається його розщеплення. Про це дізнаються, додавши до культури кілька крапель розчину Люголя - колір середовища не змінюється. Нерозщеплений крохмаль дає з цим розчином синє забарвлення.

протеолітичні властивості(Т. Е. Здатність розщеплювати білки, поліпептиди і т. П.) Вивчають на середовищах з желатином, молоком, сироваткою, пептоном. При зростанні на желатиновой середовищі мікробів, ферментують желатин, середа розріджується. Характер розрідження, що викликається різними мікробами, різний (рис. 19). Мікроби, що розщеплюють казеїн (молочний білок), викликають пептонізацію молока - воно набуває вигляду молочної сироватки. При розщепленні пептонов можуть виділятися індол, сірководень, аміак. Їх освіту встановлюють за допомогою індикаторних папірців. Фільтрувальну папір заздалегідь просочують певними розчинами, висушують, нарізають вузькими смужками довжиною 5-6 см і після посіву культури на МПБ поміщають під пробку між нею і стінкою пробірки. Після інкубації в термостаті враховують результат. Аміак викликає посиніння лакмусового папірця; при виділенні сірководню на папірці, просоченої 20% розчином свинцю ацетату і натріюгідрокарбонату, відбувається утворення свинцю сульфату - папірець чорніє; індол викликає почервоніння папірці, просоченої розчином щавлевої кислоти (див. рис. 19).

Мал. 19. Протеолітичні властивості мікроорганізмів. 1 - форми розрідження желатину; II - визначення сірководню; III - визначення індолу: 1 - негативний результат; 2 - позитивний результат

Крім зазначених середовищ, здатність мікроорганізмів розщеплювати різні поживні субстрати визначають за допомогою паперових дисків, просочених певними реактивами (системи індикаторні паперові "СІБ"). Ці диски опускають в пробірки з досліджуваної культурою і вже через 3 год інкубації в термостаті при 37 ° С по зміні кольору дисків судять про розкладанні вуглеводів, амінокислот, білків і т. Д.

Гемолітичні властивості (здатність руйнувати еритроцити) вивчають на середовищах з кров'ю. Рідкі середовища при цьому стають прозорими, а на щільних середовищах навколо колонії з'являється прозора зона (рис. 20). При утворенні метгемоглобіну середу зеленіє.

Мал. 20. Гемоліз навколо колоній, що ростуть на агарі з кров'ю

збереження культур

Виділені і вивчені культури (штами), що представляють цінність для науки або виробництва, зберігають в музеях живих культур. Загальносоюзний музей знаходиться в Державному НДІ стандартизації та контролю медичних біологічних препаратів ім. Л. А. Тарасевича (ГИСК).

Завдання зберігання - підтримати життєздатність мікроорганізмів і попередити їх мінливість. Для цього треба послабити або припинити обмін в мікробної клітці.

Один з найбільш досконалих методів тривалого збереження культур - лиофилизация - висушування у вакуумі із замороженого стану дозволяє створити стан анабіозу. Висушування проводять в спеціальних апаратах. Зберігають культури в запаяних ампулах при температурі 4 ° С, краще при -30-70 ° С.

Відновлення висушених культур. Сильно нагрівають кінчик ампули в полум'я пальника і торкаються до нього ватним тампоном, злегка * змоченим холодною водою, щоб на склі утворилися мікротріщини, через які повітря повільно просочиться всередину ампули. При цьому, проходячи через розігріті краї тріщин, повітря стерилізується.

* (При надлишку води на тампони вона може потрапити в ампулу і порушити стерильність культури: її засмокче через що утворилися мікротріщини, так як в ампулі вакуум.)

Увага! Не забувайте, що в запаяній ампулі вакуум. Якщо повітря в неї потрапляє відразу через великий отвір, може розпорошитися знаходиться в ампулі культура і статися її викид.

Давши увійти повітрю, швидко пінцетом надламують і видаляють верхівку ампули. Злегка обпалюють отвір і стерильною пастерівською піпеткою або шприцом вносять в ампулу розчинник (бульйон або ізотонічний розчин). Перемішують вміст ампули і засівають на середовища. Зростання відновлених культур в перших посівах може бути сповільнений.

Тривало зберігати культури можна також в рідкому азоті (-196 ° С) в спеціальних приладах.

Методи нетривалого збереження культур наступні: 1) субкультівірованія (періодичні пересівання на свіжі середовища) з інтервалами, що залежать від властивостей мікроорганізму, середовища і умов культивування. Між пересіву культури зберігають при 4 ° С; 2) збереження під шаром масла. Культуру вирощують в агарі стовпчиком висотою 5-6 см, заливають стерильним вазеліновим маслом (шар масла приблизно 2 см) і зберігають вертикально в холодильнику. Терміни зберігання у різних мікроорганізмів різні, тому з пробірок періодично висівають культуру, щоб перевірити її життєздатність; 3) зберігання при -20-70 ° С; 4) зберігання в запаяних пробірках. При необхідності зберігається матеріал висівають на свіжу середу.

Контрольні питання

1. Що входить в поняття "бактеріологічне дослідження"?

2. Якою має бути культура для такого дослідження?

3. Що таке колонія мікробів, культура, штам, клон?

4. Що входить в поняття "культуральні властивості бактерій"?

завдання

1. Вивчіть і опишіть кілька колоній. Перес їх на скошений агар і на сектор.

2. Вивчіть і опишіть характер росту - культури на скошеному агарі. Визначте чистоту і морфологію культури в пофарбованому препараті.

3. Перес культуру зі скошеного агару на бульйон і на диференційно-діагностичні середовища. Вивчіть і запишіть в протокол характер росту культури на цих середовищах і її ферментативні властивості.