Ферментативна активність бактерій. Відмінність ферментів від неорганічних каталізаторів. Ферменти бактерій. ферментативна активність

Поняття про ферменти

Ферментами (ензимами)називають розчинні або пов'язані з мембранами білки, наділені каталітичної активністю. (Крім білків каталітичну активністьв організмі можуть проявляти деякі РНК (рибозими) і антитіла (абзими), однак вони в тисячі разів менш ефективні, ніж ферменти.) Ці назви походять від латинського «fermentatio» - бродіння і грецького «en zym» - всередині закваски. Вони нагадують про перші джерелах ферментів. Біохімії, яка вивчає ферменти, називається ензимологія. На схемах і в рівняннях реакцій молекули ферментів позначають - Е. Речовини, перетворення яких каталізують ферменти, називають субстратами (S). продуктиензиматичною реакцііобозначают - Р. Тому що ферменти є білками, їх отримують в гомогенному вигляді тими ж способами, що і інші білки. Для ферментів характерні фізико-хімічні властивості, властиві білкам.

Відмінність ферментів від неорганічних каталізаторів:

а) прискорюють реакції значно ефективніше;

б) наділені високою специфічністю дії;

в) піддаються регуляції в фізіологічних умовах;

г) діють в м'яких умовах.

будова ферментів

Ферментами можуть бути як прості, так і складні (кон'юговані) білки, до складу яких можуть входити ліпіди, вуглеводи, іони металів, азотисті основи, похідні вітамінів. В організмі ферменти можуть функціонувати як в розчинній стані, так і у вигляді нерозчинних комплексів або входити до складу біологічних мембран.

Відмінною особливістю ферментів є наявність активного центру. Активний центр -це унікальна комбінація зближених в просторі амінокислотних залишків, яка забезпечує:

а) впізнавання молекули субстрату,

б) зв'язування субстрату з ферментом,

в) здійснення каталітичного перетворення (в разі складного ферменту в акті каталізу також бере участь кофермент, що входить до складу активного центру).

Активний центр виникає в той момент, коли білок згортається і приймає свою нативну (активну) конформацию. Структура активного центру може змінюватися при взаємодії з субстратом. За образним висловом Д. Кошланда субстрат підходить до активного центру як рука до рукавичці.

Одна молекула ферменту, особливо якщо вона складається з декількох субодиниць, може містити більше одного активного центру.

В активному центрі є дві ділянки. Перша ділянка відповідає за впізнавання і зв'язування субстрату. Він називається субстрат-зв'язуючим ділянкою або якірної майданчиком. Друга ділянка називається каталітичним, в його склад входять амінокислотні залишки, які беруть участь в акті каталізу.

Ферменти являють білки, сильно розрізняються за молекулярною масою і складності будови. Прикладом ферменту з невеликою молекулою є рибонуклеаза, що складається з однієї субодиниці з молекулярною масою 13700 Дa. (У рибонуклеази визначена амінокислотна послідовність. У 1969 р рибонуклеаза була синтезована в лабораторії Б.Мерріфілда в Нью-Йорку.) Багато ферменти складаються з декількох субодиниць, наприклад, лактатдегидрогеназа складається з чотирьох субодиниць двох видів. До теперішнього часу відомо кілька мультиферментних комплексів, що складаються з десятків різних субодиниць і декількох типів коферментів. Наприклад, піруватдегідрогеназний комплекс складається з 60 субодиниць трьох типів і п'яти типів кофакторов. Молекулярна маса такого комплексу становить 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Дa в залежності від джерела ферменту. Молекула ферменту може бути менше, ніж молекула субстрату. Наприклад: молекули ферментів амілази і рибонуклеази менше, ніж молекули їх субстратів - крохмалю і РНК.

Білкова частина складних ферментів каталитически неактивна і називається апоферментом. Зв'язування апофермента з небілковим компонентом призводить до утворення каталітично активного ферменту (холоферменту):

Багато ферменти містять в своєму складі іон металу, який може виконувати різні функції:

а) брати участь в зв'язуванні субстрату і процесі його каталітичного перетворення;

б) сприяти приєднанню коферменту до молекули ферменту;

в) стабілізувати третинну структуру ферменту (наприклад Са 2+ в амілази);

г) зв'язуючись з субстратом, утворювати істинний субстрат, на який діє фермент.

Багато коферменти є похідними вітамінів, тому порушення обміну речовин при вітамінної недостатності обумовлено зниженням активності певних ферментів.

Деякі ферменти поряд з активним центром містять аллостерічеський (регуляторний) центр -ділянку білкової глобули, поза активного центру, де можуть зв'язуватися речовини, що регулюють ферментативну активність. Ці речовини називають аллостеріческого ефекторами (аллостеріческого активаторами або інгібіторами). В результаті зв'язування ефектора з аллостерическим центром відбувається зміна структури білка, що приводить до зміни просторового розташування амінокислотних залишків в активному центрі та, в результаті, до зміни ферментативної активності.

Ферменти, що зустрічаються в одному організмі і каталізують одну і ту ж хімічну реакцію, але з різною первинною структурою білка, називаються ізоферментами. Ферменти відрізняються один від одного за такими фізико-хімічними властивостями, Як молекулярна маса, термостабільність, Субстратна специфічність, електрофоретична рухливість. Природа появи изоферментов різноманітна, але частіше за все обумовлена відмінностями в структурі генів, що кодують ці ізоферменти або їх субодиниці. Наприклад, фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ), що каталізує оборотну реакцію окислення лактату до пірувату, має чотири субодиниці двох типів М і Н, комбінація цих субодиниць лежить в основі формування п'яти ізоферментів ЛДГ (рис.1). Для діагностики захворювань серця і печінки необхідно дослідження ізоферментного спектра ЛДГ в сироватці крові, оскільки ЛДГ 1 і ЛДГ 2 активні в серцевому м'язі і нирках, а ЛДГ 4 і ЛДГ 5 - а скелетних м'язах і печінці.

Рис.1 Будова різних ізоферментів ЛДГ.

Вимірювання ферментативної активності

Визначення активності ферментів здійснюється шляхом вимірювання швидкості каталізуються реакцій. Швидкість ферментативних реакцій вимірюють по убутку концентрації субстрату або збільшення концентрації продукту за одиницю часу:

v = -ΔС S / Δτ, v = ΔC P / Δτ,

де ΔС S- зміна молярної концентрації субстрату (моль / л),

ΔC P- зміна молярної концентрації продукту реакції (моль / л),

Δτ - зміна часу (хв, сек).

Кінетичні дослідження бажано проводити при насичує концентрації субстрату, в іншому випадку фермент не матиме можливість проявити максимальну активність.

Одиниці активності ферментів:

Міжнародна одиниця ферменту (U)- це така кількість ферменту, яке каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хвилину при температурі 25 о С і оптимальному рН середовища.

В системі СІ одиницею ферменту є катав (кат)це така кількість ферменту, яке каталізує перетворення одного мольсубстрата за 1 секунду. Неважко підрахувати, що:

1 U = (1 * 10 -6 М) / 60 з = 1,67 * 10 -8 М з-1 = 1, 67 * 10 -8 кат = 16,7 нкат.

часто визначають питому активністьпрепаратів ферменту розподілом активності навішування препарату ферменту, вираженої в (U), на масу навішування в міліграмах:

А уд = U / маса препарату (мг)

При очищенні ферментів питома активність збільшується. За зростанням питомої активності можна судити про ефективність стадій очищення та чистоті ферментного препарату.

Для оцінки активності високоочищених, гомогенних препаратів ферментів розподілом числа міжнародних одиниць (U) ферменту в зразку на кількість речовини ферменту (мкмоль) в цьому зразку розраховують молярну активність(число обертів). за фізичним змістоммолярна активність - це число молекул субстрату, що піддаються перетворенню на одній молекулі ферменту за 1 хвилину або за 1секунду. Наприклад: для уреази, прискорює гідроліз сечовини, молярна активність становить 30000, трипсину - 102, глюкозоксидаза - 17000 циклів в секунду.

властивості ферментів

4.1. Механізм дії.Ферменти зміщують рівновагу каталізуються реакцій в бік утворення продуктів, таким чином, константа рівноваги реакції залишається постійною. Як і всі каталізатори, ферменти лише зменшують час досягнення цієї рівноваги. У більшості випадків ферменти прискорюють реакції в 10 7 - 10 14 разів. В основі ефективності ферментативного каталізу лежить сильне зниження енергії активації реакції за рахунок перетворення субстрату в продукт через перехідні стани.

4.2. специфічність дії. Специфічність зв'язування з субстратом і шляхи протікання ферментативної реакції визначаються апоферментом. Специфічність дії ферментів визначає спрямований обмін речовин в організмі.

Про ферментах кажуть, що вони мають вузьку субстратне специфічність, Якщо вони діють на дуже невелике коло субстратів. Іноді можна говорити про абсолютної субстратної специфічності,наприклад, каталаза каталізує тільки одну реакцію - розкладання пероксиду водню:

Для більшості ферментів характерна відносна (широка, групова) Субстратна специфічність, Коли вони каталізують групу однотипних реакцій. Наприклад, алкогольдегидрогеназа каталізує перетворення спиртів в альдегіди, причому в якості субстратів можуть виступати метанол, етанол, пропанол і інші спирти. Цікавим є той факт, що алкогольдегидрогеназа може окисляти і нелінійні спирти, а також спиртову групу, що входить до складу складних молекул, зокрема, цей фермент може каталізувати перетворення ретинолу в ретиналь. Природно, ферменти, наділені широкою субстратної специфічністю, каталізують перетворення субстратів з різною ефективністю.

Ферменти наділені також стереохимической специфічністю: Їх активний центр розпізнає молекули субстратів по просторової конфігурації. Наприклад, оксидази L-амінокислот активні тільки щодо L-амінокислот і абсолютно не діють на їх D-аналоги. Для окисного дезамінування D-амінокислот в живих організмах є оксидази D-амінокислот, що не діють на L-амінокислоти. Саме здатність активного центру зв'язуватися з певними стереоізомерами субстрату лежить в основі функціонування таких ферментів, як рацемази, які перетворюють одні стереоізомери в інші.

Специфічність шляхів перетворенняполягає в тому, що один субстрат під дією різних ферментів може перетворюватися в продукти, що розрізняються за структурою та ролі в метаболізмі.

Наведемо приклад: оксидази L-амінокислотдіють на L-амінокислоти, перетворюючи їх в альфа-кетокислот з утворенням аміаку і пероксиду водню.

Декарбоксилази L-амінокислотзв'язуються з тими ж субстратами, але каталізують іншу реакцію: декарбоксилирование з утворенням біогенних амінів і виділенням вуглекислого газу.

Ще одним прикладом є можливість перетворення глюкозо-6 фосфату під дією різних ферментів, по одному з можливих метаболічних шляхів:

4.3. термолабильность .

Як і багато білків, при підвищенні температури ферменти піддаються термічній денатурації, що призводить до порушення нативної конформації ферменту і зміни структури активного центру. Ферменти ссавців починають помітно денатурувати при температурах вище 40 о С.

У зв'язку з вищесказаним, ферментні препарати бажано зберігати при знижених температурах. Одним з кращих шляхів збереження ферментів є їх лиофилизация (висушування при температурі нижче -70 ° С у вакуумі), переведення в частково денатуровані стан за допомогою солей амонію і приміщення в холодильник.

4.4. Залежність швидкості реакції від температури.Швидкість ферментативних реакцій, як і будь-яких хімічних реакцій, залежить від температури. При підвищенні температури на 10 о С швидкість реакції збільшується в 2-4 рази згідно з правилом Вант-Гоффа. Однак при температурах вище 40 ° С істотною стає денатурація ферментів, що призводить до зменшення сумарної активності (рис. 2):

Мал. 2. Залежність швидкості ферментативної реакції від температури.

4.5. Залежність швидкості реакції від рН.Залежність швидкості ферментативної реакції від рН має колоколообразний вид (рис. 3). Значення рН, при яких спостерігається найбільш висока швидкість ферментативної реакції, називають оптимальними (рН-оптимум). Характер кривих і значення рН-оптимуму залежить від природи заряджених груп субстрату і заряджених груп ферменту (особливо тих, які входять в активний центр). Оптимум рН для більшості ферментів лежить в межах від 6,0 до 8,0 (рис. 3).

Мал. 3. Залежність швидкості ферментативної реакції від рН.

Однак, є й винятки, наприклад, пепсин найбільш активний при рН 1,5 - 2,0, а лужна фосфатаза при рН 10,0 - 10,5 (рис. 4)

Мал. 4. Залежності швидкості ферментативної реакції (v) від рН середовища.

При екстремальних (дуже низьких або дуже високих) значеннях рН відбувається порушення третинної структури молекули ферменту, що приводить до втрати ферментативної активності.

Схожа інформація.

Ферменти - це особливий вид протеїнів, яким природою відведена роль каталізаторів різних хімічних процесів.

Цей термін постійно на слуху, правда, далеко не всі розуміють, що таке фермент або ензим, які функції виконує ця речовина, а також чим відрізняються ферменти від ензимів і відрізняються взагалі. Все це зараз і дізнаємося.

Без цих речовин ні люди, ні тварини не змогли б перетравлювати їжу. А вперше до застосування ферментів в побуті людство вдався понад 5 тисяч років тому, коли наші предки навчилися зберігати молоко в «посуді» зі шлунків тварин. В таких умовах під впливом сичужного ферменту молоко перетворювалося в сир. І це тільки один з прикладів роботи ензиму в якості каталізатора, що прискорює біологічні процеси. Сьогодні ферменти незамінні в промисловості, вони важливі для виробництва цукру, маргаринів, йогуртів, пива, шкіри, текстилю, спирту і навіть бетону. У миючих засобах і пральних порошках також присутні ці корисні речовини - допомагають виводити плями при низьких температурах.

Історія відкриття

Ензим в перекладі з грецького означає «закваска». А відкриття цієї речовини людство зобов'язане голландцеві Яну Баптисту Ван-Гельмонт, що жив в XVI столітті. Свого часу він дуже зацікавився спиртовим бродінням і в ході дослідження знайшов невідому речовину, що прискорює цей процес. Голландець назвав його fermentum, що в перекладі означає «бродіння». Потім, майже трьома століттями пізніше, француз Луї Пастер, також спостерігаючи за процесами бродіння, прийшов до висновку, що ферменти - не що інше, як речовини живої клітини. А через деякий час німець Едуард Бюхнер добув фермент з дріжджів і визначив, що ця речовина не є живим організмом. Він також дав йому свою назву - «зимаза». Ще через декілька років інший німець Віллі Кюне запропонував все білкові каталізатори розділити на дві групи: ферменти та ензими. Причому другим терміном він запропонував називати «закваску», дії якої поширюються поза живих організмів. І лише 1897 рік поклав край всім науковим суперечкам: обидва терміни (ензим і фермент) вирішено використовувати як абсолютні синоніми.

Структура: ланцюг з тисяч амінокислот

Всі ферменти є білками, але не всі білки - ферменти. Як і інші протеїни, ензими складаються з. І що цікаво, на створення кожного ферменту йде від ста до мільйона амінокислот, нанизаних, немов перли на нитку. Але ця нитка не буває рівною - зазвичай вигнута в сотні разів. Таким чином, створюється тривимірна унікальна для кожного ферменту структура. Між тим, молекула ензиму - порівняно велике освіту, і лише невелика частина його структури, так званий активний центр, бере участь в біохімічних реакціях.

Кожна амінокислота з'єднана з іншого певним типом хімічного зв'язку, А кожен фермент має свою унікальну послідовність амінокислот. Для створення більшості з них використовуються приблизно 20 видів аміновеществ. Навіть незначні зміни послідовності амінокислот можуть кардинально міняти зовнішній вигляді «таланти» ферменту.

біохімічні властивості

Хоча за участю ферментів в природі відбувається величезна кількість реакцій, але всі вони можуть бути розгрупувати на 6 категорій. Відповідно, кожна з цих шести реакцій протікає під впливом певного типу ферментів.

Реакції за участю ензимів:

Окислення і відновлення.

Ферменти, що беруть участь в цих реакціях, називаються Оксидоредуктази. Як приклад можна згадати як, алкогольдегідрогенази перетворять первинні спиртив альдегід.

Реакція перенесення групи.

Ферменти, завдяки яким відбуваються ці реакції, називаються трансферазу. Вони володіють умінням переміщати функціональні групи від однієї молекули до іншої. Так відбувається, наприклад, коли аланінамінотрансферази переміщують альфа-аміногрупи між аланином і аспартатом. Також трансферази переміщують фосфатні групи між АТФ і іншими сполуками, а з залишків глюкози створюють дисахариди.

Гідроліз.

Гідролази, які беруть участь в реакції, вміють розривати одинарні зв'язку, додаючи елементи води.

Створення або видалення подвійного зв'язку.

Цей вид реакцій негидролитическим шляхом відбувається за участю ліази.

Ізомеризація функціональних груп.

У багатьох хімічних реакціях положення функціональної групи змінюється в межах молекули, але сама молекула складається з того ж кількості і типів атомів, що були до початку реакції. Іншими словами, субстрат і продукт реакції є ізомерами. Такого типу трансформації можливі під впливом ферментів ізомерази.

Освіта одинарного зв'язку з усуненням елемента води.

Гідролази руйнують зв'язок, додаючи в молекулу елементи води. Ліази здійснюють зворотну реакцію, видаляючи водну частину з функціональних груп. Таким чином, створюють просту зв'язок.

Як працюють в організмі

Ферменти прискорюють практично всі хімічні реакції, Що відбуваються в клітинах. Вони мають життєво важливої значення для людини, полегшують травлення і прискорюють метаболізм.

Деякі з цих речовин допомагають руйнувати занадто великі молекули на більш дрібні «шматки», які організм зможе переварити. Інші навпаки пов'язують дрібні молекули. Але ферменти, кажучи науковою мовою, мають високу селективність. Це означає, що кожне з цих речовин здатне прискорювати тільки певну реакцію. Молекули, з якими «працюють» ферменти, називаються субстратами. Субстрати в свою чергу створюють зв'язок з частиною ферменту, що називається активним центром.

Існують два принципи, що пояснюють специфіку взаємодії ферментів і субстратів. У так званої моделі «ключ-замок» активний центр займає в субстраті місце строго певної конфігурації. Відповідно до іншої моделі, обидва учасники реакції, активний центр і субстрат, змінюють свої форми, щоб з'єднатися.

За яким би принципу не відбувалося взаємодія результат завжди однаковий - реакція під впливом ензиму протікає у багато разів швидше. Внаслідок такої взаємодії «народжуються» нові молекули, які потім відділяються від ферменту. А речовина-каталізатор продовжує виконувати свою роботу, але вже за участю інших частинок.

Гіпер- і гипоактивность

Бувають випадки, коли ензими виконують свої функції з неправильною інтенсивністю. Надмірна активність викликає надмірне формування продукту реакції і дефіцит субстрату. В результаті - погіршення самопочуття і серйозні хвороби. Причиною гіперактивності ензиму може бути як генетичне порушення, так і надлишок вітамінів або, використовуваних в реакції.

Гипоактивность ферментів може навіть стати причиною смерті, коли, наприклад, ензими не виводять з організму токсини або виникає дефіцит АТФ. Причиною такого стану також можуть бути мутовані гени або, навпаки, гіповітаміноз і дефіцит інших поживних речовин. Крім того, знижена температура тіла аналогічно уповільнює функціонування ензимів.

Каталізатор і не тільки

Сьогодні можна часто почути про користь ферментів. Але що таке ці речовини, від яких залежить працездатність нашого організму?

Ензими - це біологічні молекули, життєвий цикл яких не визначається рамками від народження і смерті. Вони просто працюють в організмі до тих пір, поки не розчиняться. Як правило, це відбувається під впливом інших ферментів.

В процесі біохімічної реакції вони не стають частиною кінцевого продукту. Коли реакція завершена, фермент залишає субстрат. Після цього речовина готова знову приступити до роботи, але вже на іншій молекулі. І так триває стільки, скільки необхідно організму.

Унікальність ферментів в тому, що кожен з них виконує тільки одну, йому відведену функцію. Біологічна реакція відбувається тільки тоді, коли фермент знаходить правильний для нього субстрат. Ця взаємодія можна порівняти з принципом роботи ключа і замка - тільки правильно підібрані елементи зможуть «спрацюватися». Ще одна особливість: вони можуть працювати при низьких температурах і помірному рН, а в ролі каталізаторів є більш стабільними, ніж будь-які інші хімічні речовини.

Ферменти як каталізатори прискорюють процеси метаболізму і інші реакції.

Як правило, ці процеси складаються з певних етапів, кожний з яких вимагає роботи певного ензиму. Без цього цикл перетворення або прискорення не зможе завершитися.

Мабуть, з усіх функцій ферментів найбільш відома - роль каталізатора. Це означає, що ензими комбінують хімічні реагенти таким чином, щоб знизити енергетичні витрати, необхідні для більш швидкого формування продукту. Без цих речовин хімічні реакції протікали б в сотні разів повільніше. Але на цьому здатності ензимів не вичерпуються. Всі живі організми містять енергію, необхідну їм для продовження життя. АТФ, або АТФ, це свого роду заряджена батарейка, яка забезпечує клітини енергією. Але функціонування АТФ неможливо без ферментів. І головний ензим, що виробляє АТФ, - синтаза. Для кожної молекули глюкози, яка трансформується в енергію, синтаза виробляє близько 32-34 молекул АТФ.

Крім цього, ензими (ліпаза, амілаза, протеаза) активно застосовуються в медицині. Зокрема, служать компонентом ферментативних препаратів, таких як «Фестал», «Мезим», «Панзинорм», «Панкреатин», що застосовуються для лікування нетравлення шлунка. Але деякі ензими здатні також впливати на кровоносну систему (розчиняють тромби), прискорювати загоєння гнійних ран. І навіть в протиракової терапії також вдаються до допомоги ферментів.

Фактори, що визначають активність ензимів

Оскільки ензим здатний прискорювати реакції у багато разів, його активність визначається так званим числом оборотів. Цей термін позначає кількість молекул субстрату (реагує речовини), яку здатна трансформувати 1 молекула ферменту за 1 хвилину. Однак існує ряд факторів, що визначають швидкість реакції:

Концентрація субстрату.

Збільшення концентрації субстрату веде до прискорення реакції. Чим більше молекул діючої речовини, тим швидше протікає реакція, оскільки задіяно більше активних центрів. Однак прискорення можливо тільки до тих пір, поки не задіюються всі молекули ферменту. Після цього, навіть підвищення концентрації субстрату не приведе до прискорення реакції.

Температура.

Зазвичай підвищення температури веде до прискорення реакцій. Це правило працює для більшості ферментативних реакцій, але тільки до тих пір, поки температура не підніметься вище 40 градусів за Цельсієм. Після цієї позначки швидкість реакції, навпаки, починає різко знижуватися. Якщо температура опуститься нижче критичної позначки, швидкість ферментативних реакцій підвищиться знову. Якщо температура продовжує рости, ковалентні зв'язки руйнуються, а каталицької активність ферменту втрачається назавжди.

Кислотність.

На швидкість ферментативних реакцій також впливає показник рН. Для кожного ферменту існує свій оптимальний рівень кислотності, при якому реакція проходить найбільш адекватно. Зміна рівня рН позначається на активності ферменту, а значить, і швидкості реакції. Якщо зміни занадто великі, субстрат втрачає здатність зв'язуватися з активним ядром, а ензим не може каталізувати реакцію. З відновленням необхідного рівня рН, активність ферменту також відновлюється.

Ферменти, присутні в людському організмі, Можна розділити на 2 групи:

метаболічні;
травні.

Метаболічні «працюють» над нейтралізацією токсичних речовин, а також сприяють виробленню енергії і білків. Ну і, звичайно, прискорюють біохімічні процеси в організмі.

За що відповідають травні - зрозуміло з назви. Але і тут спрацьовує принцип селективності: певний тип ферментів впливає тільки на один вид їжі. Тому для поліпшення травлення можна вдатися до маленької хитрості. Якщо організм погано перетравлює щось з їжі, значить треба доповнити раціон продуктом, що містить фермент, який здатний розщепити важко перетравлювану їжу.

Харчові ферменти - каталізатори, які розщеплюють продукти харчування до стану, в якому організм здатний поглинати з них корисні речовини. Травні ензими бувають декількох типів. У людському організмі різні види ферментів містяться на різних ділянках травного тракту.

Ротова порожнина

На цьому етапі на їжу впливає альфа-амілаза. Вона розщеплює вуглеводи, крохмалі і глюкозу, які містяться в картоплі, фруктах, овочах та інших продуктах харчування.

шлунок

Тут пепсин розщеплює білки до стану пептидів, а желатинази - желатин і колаген, що містяться в м'ясі.

Підшлункова залоза

На цьому етапі «працюють»:

трипсин - відповідає за розщеплення білків;
альфа-хімотрипсин - допомагає засвоєнню протеїнів;
еластази - розщеплюють деякі види білків;
нуклеази - допомагають розщеплювати нуклеїнові кислоти;
стеапсін - сприяє засвоєнню жирної їжі;
амілаза - відповідає за засвоєння крохмалю;
ліпаза - розщеплює жири (ліпіди), що містяться в молочних продуктах, горіхах, маслах і м'ясі.

Тонка кишка

Над харчовими частинками «чаклують»:

пептідази - розщеплюють пептидні сполуки до рівня амінокислот;
сахараза - допомагає засвоювати складні цукру і крохмалі;
мальтаза - розщеплює дисахариди до стану моносахаридів (солодовий цукор);
лактаза - розщеплює лактозу (глюкозу, що міститься в молочних продуктах);
ліпаза - сприяє засвоєнню тригліцеридів, жирних кислот;
ерепсін - впливає на протеїни;
ізомальтаза - «працює» з мальтозою і ізомальтози.

Товста кишка

Тут функції ферментів виконують:

кишкова паличка - відповідає за перетравлення лактози;
лактобактерії - впливають на лактозу і деякі інші вуглеводи.

Крім названих ензимів, існують ще:

діастаза - перетравлює рослинний крохмаль;
инвертаза - розщеплює сахарозу (столовий цукор);
глюкоамілаза - перетворює крохмаль в глюкозу;
альфа-галактозидаза - сприяє переварюванню бобів, насіння, соєвих продуктів, кореневих овочів і листових;
бромелайн - фермент, отриманий з, сприяє розщепленню різних видівбілків, ефективний при різних рівнях кислотності середовища, володіє протизапальними властивостями;
папаин - фермент, виділений із сирої папайї, сприяє розщепленню дрібних і великих протеїнів, ефективний в широкому діапазоні субстратів і кислотності.
целлюлаза - розщеплює целюлозу, рослинні волокна (в людському організмі не виявлено);
ендопротеаз - розщеплює пептидні зв'язки;
екстракт бичачої жовчі - ензим тваринного походження, стимулює моторику кишечника;
ксиланазу - розщеплює глюкозу з зернових.

Каталізатори в продуктах

Ферменти мають вирішальне значення для здоров'я, оскільки допомагають організму розщеплювати харчові компоненти до стану, придатного для використання поживних речовин. Кишечник і підшлункова залоза виробляють широкий спектр ферментів. Але крім цього, багато їх корисних речовин, що сприяють травленню, містяться також і в деяких продуктах.

Ферментовані продукти є практично ідеальним джерелом корисних бактерій, необхідних для правильного травлення. І в той час, коли аптечні пробіотики «працюють» тільки в верхньому відділі травної системи і часто не добираються до кишечника, ефект від ферментативних продуктів відчувається у всьому шлунково-кишковому тракті.

Наприклад, абрикоси містять в собі суміш корисних ензимів, в тому числі инвертазу, яка відповідає за розщеплення глюкози і сприяє швидкому вивільненню енергії.

Натуральним джерелом ліпази (сприяє більш швидкому переварюванню ліпідів) може послужити авокадо. В організмі ця речовина виробляє підшлункова залоза. Але щоб полегшити життя цього органу, можна побалувати себе, наприклад, салатом з авокадо - смачно і корисно.

Крім того, що банан, мабуть, найвідоміший джерело калію, він також поставляє в організм амилазу і мальтазу. Амілаза міститься також в хлібі, картоплі, крупах. Мальтаза сприяє розщепленню мальтози, так званого солодового цукру, який у великій кількості представлений в пиві і кукурудзяному сиропі.

Інший екзотичний фрукт - ананас містить в собі цілий набір ензимів, в тому числі і бромелайн. А він, згідно з деякими дослідженнями, ще й має протиракові і протизапальними властивостями.

Екстремофіли і промисловість

Екстремофіли - це речовини, здатні зберігати життєдіяльність в екстремальних умовах.

Живі організми, а також ферменти, що дозволяють їм функціонувати, були знайдені в гейзерах, де температура близька до точки кипіння, і глибоко в льодах, а також в умовах крайньої солоності (Долина Смерті в США). Крім того, вчені знаходили ензими, для яких рівень рН, як виявилося, також не принципова вимога для ефективної роботи. Дослідники з особливим інтересом вивчають ферменти-екстремофили, як речовини, які можуть бути широко використані в промисловості. Хоча і сьогодні ензими вже знайшли своє застосування в індустрії як біологічно і екологічно чисті речовини. До застосування ензимів вдаються в харчовій промисловості, косметології, виробництві побутової хімії.

Більш того, «послуги» ферментів в таких випадках обходяться дешевше, ніж синтетичних аналогів. Крім того, натуральні речовини здатні біологічно руйнуватися, що робить їх використання безпечним для екології. У природі існують мікроорганізми, здатні розщепити ферменти на окремі амінокислоти, які потім стають компонентами нової біологічної ланцюжка. Але це, так би мовити, вже зовсім інша історія.

Активність ферментів.під активністю ферменту розуміють таке його кількість, яке каталізує перетворення певної кількості субстрату в одиницю часу. Для вираження активності препаратів ферментів використовують дві альтернативні одиниці: міжнародну (МО) і катав (кат). за міжнародну одиницю активності ферменту прийнято таке його кількість, яке каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату в продукт за 1 хв в стандартних умовах (зазвичай оптимальних). один катав позначає кількість ферменту, катализирующее перетворення 1 моля субстрату за 1 с (1 кат = 6 ∙ 10 7 МО). При бімолекулярний реакції A + В = С + D за одиницю активності ферменту приймають таке його кількість, яке каталізує перетворення 1 мкмоль А чи В, або 2 мкмоль А (якщо В = А), за 1 хв.

Часто ферментні препарати характеризуються питомою активністю, яка відображає ступінь очищення ферменту. питома активність - це число одиниць активності ферменту, що припадають на 1 мг білка.

молекулярна активність (Число оборотів ферменту) - число молекул субстрату, що піддається перетворенню однієї молекулою ферменту за 1 хв при повному насиченні ферменту субстратом. Вона дорівнює числу одиниць активності ферменту, поділеній на кількість ферменту, виражене в мікромолі. Поняття молекулярної активності може бути застосовано тільки для чистих ферментів.

Коли відома кількість активних центрів в молекулі ферменту, вводиться поняття активності каталітичного центру . Вона характеризується числом молекул субстрату, яке піддається перетворенню за 1 хв в розрахунку на один активний центр.

Активність ферментів сильно залежить від зовнішніх умов, серед яких першорядне значення мають температура і рН середовища. Підвищення температури в інтервалі 0-50 ° С зазвичай призводить до плавного збільшення ферментативної активності, що пов'язано з прискоренням процесів формування фермент-субстратного комплексу і всіх наступних подій каталізу. При підвищенні температури на кожні 10 ° С швидкість реакції збільшується приблизно вдвічі (правило Вант-Гоффа). Однак подальше зростання температури (> 50 ° С) супроводжується підвищенням кількості инактивированного ферменту за рахунок денатурації його білкової частини, що виражається в зниженні активності. Кожен фермент характеризується температурним оптимумом- значенням температури, при якому реєструється найбільша його активність.

Залежність активності ферментів від значення рН середовища має складний характер. Для кожного ферменту характерний оптимум рН середовища, При якому він проявляє максимальну активність. При видаленні від цього значення в ту або іншу сторону ферментативна активність знижується. Це пояснюється зміною стану активного центру ферменту (зменшенням або збільшенням іонізації функціональних груп), а також третинної структури всієї білкової молекули, яка залежить від співвідношення в ній катіонних і аніонних центрів. Більшість ферментів мають оптимум рН в області нейтральних значень. Однак є ферменти, що проявляють максимальну активність при рН 1,5 (пепсин) або 9,5 (аргіназа). При роботі з ферментами необхідно підтримувати рН за допомогою відповідного буферного розчину.

Активність ферментів схильна до значних коливань в залежності від впливу інгібіторів(Речовин, частково або повністю знижують активність) і активаторів(Речовин, що збільшують активність). Їх роль виконують катіони металів, деякі аніони, переносники фосфатних груп, відновлювальних еквівалентів, специфічні білки, проміжні і кінцеві продукти метаболізму і ін.

Принципи ферментативної кінетики.Суть кінетичних досліджень полягає у визначенні максимальної швидкості ферментативної реакції ( V max) і константи Міхаеліса До М. Ферментативна кінетика вивчає швидкості кількісних перетворень одних речовин в інші під дією ферментів. Швидкість ферментативної реакції вимірюють по убутку субстрату або приросту утворюється продукту за одиницю часу, або по зміні концентрації однієї з суміжних форм коферменту.

вплив концентрації ферментуна швидкість реакції виражається в наступному: якщо концентрація субстрату постійна (за умови надлишку субстрату), то швидкість реакції пропорційна концентрації ферменту. Для кінетичних досліджень використовують концентрацію ферменту 10  8 М активних центрів. Оптимальне значення концентрації ферменту визначають з графіка залежності активності ферменту від його концентрації. Оптимальним вважається значення, що лежить на плато отриманого графіка в області значень активності ферменту, мало залежать від його концентрації (рис. 4.3).

Мал. 4.3. Залежність швидкості ферментативної реакції

від концентрації ферменту

Для вивчення впливу концентрації субстратуна швидкість ферментативної реакції спочатку будують кінетичну криву, що відображає зміну концентрації субстрату (S 1) або продукту (Р 1) у часі (рис. 4.4) і вимірюють початкову швидкість ( V 1) реакції як тангенс кута нахилу дотичної до кривої в нульовій точці.

Мал. 4.4. Кінетичні криві ферментативної реакції

Побудувавши кінетичні криві для інших значень концентрації даного субстрату (S 2, S 3, S 4 і т. Д.) Або продукту (Р 2, Р 3, Р 4 і т. Д.) І визначивши початкові швидкості ( V 2, V 3 , V 4 і т. Д.) Реакції, будують графік залежності початкової швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату (при постійній концентрації ферменту), який має вигляд гіперболи (рис. 4.5).

Мал. 4.5. Залежність початкової швидкості ферментативної реакції

від концентрації субстрату

Кінетика багатьох ферментативних реакцій описується рівнянням Міхаеліса  Ментен. При постійній концентрації ферменту і малих значеннях концентрації субстрату[S] початкова швидкість реакції прямо пропорційна [S] (рис. 4.5). У цьому випадку говорять про напівнасичення ферменту субстратом, коли половина молекул ферменту знаходиться в формі фермент-субстратного комплексу і швидкість реакції V = 1/2V max. Відносно субстрату реакція має 1-й порядок (швидкість реакції прямо пропорційна концентрації одного реагує речовини) або 2-й порядок (швидкість реакції пропорційна добутку концентрацій двох реагуючих речовин).

при високих значеннях концентрації субстрату[S] швидкість реакції майже не залежить від [S]: при подальшому збільшенні [S] швидкість реакції зростає все повільніше і в результаті стає постійною (максимальної) (рис. 4.5). При цьому досягається повне насичення ферменту субстратом, коли всі молекули ферменту знаходяться в формі фермент-субстратного комплексу і V = V max. Відносно субстрату реакція має 0-й порядок (швидкість реакції не залежить від концентрації реагуючих речовин).

У 1913 р Л. Міхаеліс та М. Ментен запропонували просту модель, що пояснює таку кінетику. Відповідно до цієї моделі, утворення специфічного фермент-субстратного комплексу є необхідним проміжним етапом каталізу.

k 1 k 3

Е + S ⇄ ЕS → Е + Р

Фермент Е з'єднується з субстратом S, утворюючи ЕS-комплекс. Константа швидкості цього процесу k 1. Доля ЕS-комплексу складається двояко: він може або диссоциировать на фермент Е і субстрат S з константою швидкості k 2, або піддатися подальшому перетворенню, утворюючи продукт Р і вільний фермент Е, з константою швидкості k 3. При цьому постулюється, що продукт реакції не перетворюється у вихідний субстрат. Ця умова дотримується на початковій стадії реакції, поки концентрація продукту невелика.

Швидкість каталізу визначають в стаціонарних умовах, Коли концентрація проміжних продуктів залишається постійною, тоді як концентрація вихідних речовин і кінцевих продуктів змінюється. Це має місце в тому випадку, коли швидкість утворення ЕS-комплексу дорівнює швидкості його розпаду.

Можна ввести нову константу К М - константу Міхаеліса(Моль / л), яка дорівнює

Рівняння Міхаеліса - Ментен, Що виражає кількісне співвідношення між швидкістю ферментативної реакції і концентрацією субстрату, має вигляд

(4.2)

Це рівняння відповідає графіку залежності швидкості реакції від концентрації субстрату. при низьких концентраціях субстрату, Коли [S] набагато нижче К М, V = V max [S] / К М, т. е. швидкість реакції прямо пропорційна концентрації субстрату. при високих концентраціях субстрату, Коли [S] набагато вище До М, V = V max, т. е. швидкість реакції максимальна і не залежить від концентрації субстрату.

Якщо [S] = К М, то V = V max / 2.

Таким чином, К М дорівнює концентрації субстрату, при якій швидкість реакції складає половину максимальної.

Константа Міхаеліса (К М) і максимальна швидкість реакції ( V max) - важливі характеристики швидкості при різних концентраціях субстрату. V max - величина постійна для кожного ферменту дозволяє оцінити ефективність його дії.

Константа Міхаеліса показує спорідненість субстрату до ферменту (в разі, коли k 2 >> k 3): чим менше К М, тим більше спорідненість і вище швидкість реакції, і навпаки. Кожен субстрат характеризується своєю величиною К М для даного ферменту і за їх значенням можна судити про субстратної специфічності ферменту. Константа Міхаеліса залежить від природи субстрату, температури, рН, іонної сили розчину та наявності інгібіторів.

У зв'язку з тим, що визначення V max і К М безпосередньо з графічної залежності Міхаеліса - Ментен (рис.4.5) є неоднозначним, вдаються до лінеаризації даного рівняння. Для цього його перетворять в таку форму, щоб графічно це були прямий. Існує кілька методів лінеаризації, серед яких найбільш часто застосовують методи Лайнуівера - Берка і Еді - Хофсті.

перетворення Лайнуівера - Берка має вигляд

(4.3)

Будують графік залежності 1 / V = f(1 / [S]) і отримують пряму лінію, перетин якої з віссю ординат дає величину 1 / V max; відрізок, що відсікається прямою на осі абсцис дає величину -1 / К М, а тангенс кута нахилу прямої до осі абсцис дорівнює К М / V max (рис. 4.6). Цей графік дозволяє більш точно визначати V max. Як ми побачимо нижче, з цього графіка можна також отримати цінну інформацію, що стосується інгібування активності ферменту.

Мал. 4.6. Метод лінеаризації рівняння Міхаеліса - Ментен

(По Лайнуіверу - Берк)

метод Еді - Хофсті заснований на перетворенні рівняння Міхаеліса - Ментен шляхом множення обох його частин на V max:

(4.4)

Графік в координатах Vі V/ [S] являє собою пряму лінію, перетин якої з віссю ординат дає величину V max, а відрізок, що відсікається прямою на осі абсцис, - величину V max / К М (рис. 4.7). Він дозволяє дуже просто визначати До М і V max, а також виявляти можливі відхилення від лінійності, не виявляються на попередньому графіку.

Мал. 4.7. Метод лінеаризації рівняння Міхаеліса - Ментен

(По Еді - Хофсті)

Пригнічення активності ферментів.Дія ферментів можна повністю або частково придушити певними хімічними речовинами - інгібіторами . За характером своєї дії інгібітори поділяються на оборотні та необоротні. В основі такого поділу лежить міцність зв'язування інгібітора з ферментом.

оборотні інгібітори - це з'єднання, які нековалентно взаємодіють з ферментом і при їх видаленні активність ферменту відновлюється. Оборотне інгібування може бути конкурентним, неконкурентним і безконкурентному.

прикладом конкурентного гальмуванняє дія структурних аналогів субстрату, які можуть зв'язуватися з активним центром ферменту схожим способом, як і субстрат, не перетворюючись проте в продукт і перешкоджаючи взаємодії ферменту з істинним субстратом, т. е. має місце конкуренція між субстратом і інгбітором за зв'язування з активним центром ферменту . В результаті утворення комплексів фермент-інгібітор (EI) концентрація ES-комплексів зменшується і, як наслідок, падає швидкість реакції. Іншими словами, конкурентний інгібітор зменшує швидкість каталізу шляхом зниження частки молекул ферменту, що зв'язали субстрат.

Вимірювання швидкостей реакцій при різних концентраціях субстрату дозволяє відрізняти конкурентне інгібування від неконкурентного. При конкурентному інгібуванні на графіку залежності 1 / V=f(1 / [S]) прямі перетинають вісь ординат в одній точці 1 / V max незалежно від присутності інгібітора, але в присутності інгібітора збільшується тангенс кута нахилу прямої до осі абсцис, т. е. V max не змінюється, а К М збільшується, що свідчить про зменшення спорідненості субстрату до ферменту в присутності інгібітора (рис. 4.8). Отже, при досить високій концентрації субстрату в умовах конкуренції за активний центр, коли субстрат витісняє інгібітор з активного центру, інгібування може бути усунуто, і швидкість каталізуються реакції відновлюється. При цьому рівняння Міхаеліса - Ментен має вигляд

(4.5)

де [I] - концентрація інгібітора; K i - константа інгібування.

Константа інгібування характеризує спорідненість ферменту до інгібітору і являє собою константу дисоціації ЕI-комплексу:

(4.6)

У присутності конкурентного інгібітора тангенс кута нахилу прямої до осі абсцис збільшується на величину (1 + [I] / K i).

Мал. 4.8. Конкурентне інгібування:

а - схема; б - графічне вираження по Лайнуіверу - Берк

при неконкурентном ингибированииінгібітор відрізняється за структурою від субстрату і пов'язується не з активним, а з аллостерическим центром ферменту. Це веде до зміни конформації активного центру ферменту, що супроводжується зниженням каталітичної активності ферменту. Причому інгібітор може зв'язуватися не тільки з вільним ферментом (Е + I → EI), але і з фермент-субстратним комплексом (ES + I → ESI). Обидві форми EI і ESI не активні. Субстрат і інгібітор можуть бути одночасно пов'язані молекулою ферменту, але їхні уділи зв'язування не перекриваються. Дія неконкурентного інгібітору полягає в зменшенні числа обертів ферменту, а не в зниженні частки зв'язали субстрат молекул ферменту. Інгібітор не перешкоджає утворенню ES-комплексів, але гальмує перетворення субстрату в продукт. Внаслідок цього V max зменшується, т. е. в присутності інгібітора перетин прямої з віссю ординат відбудеться в більш високій точці (рис. 4.9). У тій же мірі зростає і тангенс кута нахилу прямої до осі абсцис, рівний К М / V max I. До М на відміну від V max не змінюється, тому неконкурентное інгібування не може бути усунуто збільшенням концентрації субстрату.

Мал. 4.9. Неконкурентное інгібування:

а - схема; б - графічне вираження по Лайнуіверу - Берк

Максимальна швидкість реакції V max I в присутності неконкурентного інгібітора описується рівнянням

(4.7)

В окремому випадку безконкурентного інгібування, Коли інгібітор зв'язується тільки з ES-комплексом і не зв'язується з вільним ферментом, на графіку залежності 1 / V = f(1 / [S]) прямі паралельні один одному і перетинають осі ординат і абсцис в різних точках (рис. 4.10).

Мал. 4.10. Безконкурентному інгібування:

а - схема; б - графічне вираження по Лайнуіверу - Берк

необоротні інгібітори - це високореакціонноспособние сполуки різної хімічної природи, які можуть взаємодіяти з функціонально важливими групами активного центру, утворюючи міцні ковалентні зв'язки. Це призводить до безповоротної втрати активності ферменту. У зв'язку з цим теорія Міхаеліса - Ментен, заснована на припущенні, що приєднання інгібітора до ферменту має оборотний характер, в даному випадку не застосовується.

Прикладом необоротного інгібування служить взаємодія ферментів з іонами важких металів, які приєднуються до сульфгідрильним групам цістеіновних залишків ферменту і утворюють при цьому меркаптіди - практично недіссоціірующіе з'єднання, або ковалентний модифікація ферменту під дією алкилірующих агентів.

Ферментативна активність мікроорганізмів багата і різноманітна. По ній можна встановити не тільки видову і типову приналежність мікроба, але і визначити його варіанти (так звані біовари). Розглянемо основні ферментативні властивості і їх якісне визначення.

Розщеплення вуглеводів (сахаролитической активність), т. Е. Здатність розщеплювати цукру і багатоатомні спирти з утворенням кислоти або кислоти і газу, вивчають на середовищах Гісса, які містять той чи інший вуглевод і індикатор. Під дією утворюється при розщепленні вуглеводу кислоти індикатор змінює забарвлення середовища. Тому ці середовища названі «строкатий ряд». Мікроби, що не ферментують даний вуглевод, ростуть на середовищі, не змінюючи її. Наявність газу встановлюють за освітою бульбашок в середовищах з агаром або по скупченню його в «поплавці» на рідких середовищах. «Поплавок» - вузька скляна трубочка з запаяним кінцем, зверненим вгору, яку до стерилізації поміщають в пробірку з середовищем.

Крім того, сахаролитической активність вивчають на середовищах Ендо, ЕМС, Плоскірєва. Мікроорганізми, зброджуючи до кислоти знаходиться в цих середовищах молочний цукор (лактозу), утворюють забарвлені колонії - кислота змінює колір наявного в середовищі індикатора. Колонії мікробів, які не ферментують лактозу, безбарвні.

Молоко при зростанні мікробів, сбраживающих лактозу, згортається.

При зростанні мікроорганізмів, що утворюють амілазу, на середовищах з розчинною крохмалем відбувається його розщеплення. Про це дізнаються, додавши до культури кілька крапель розчину Люголя - колір середовища не змінюється. Нерозщеплений крохмаль дає з цим розчином синє забарвлення.

Протеолітичні властивості (т. Е. Здатність розщеплювати білки, поліпептиди і т. П.) Вивчають на середовищах з желатином, молоком, сироваткою, пептоном. При зростанні на желатиновой середовищі мікробів, ферментують желатин, середа розріджується. Характер розрідження, що викликається різними мікробами, різний. Мікроби, що розщеплюють казеїн (молочний білок), викликають пептонізацію молока-воно набуває вигляду молочної сироватки. При розщепленні пептонов можуть виділятися індол, сірководень, аміак. Їх освіту встановлюють за допомогою індикаторних папірців. Фільтрувальну папір заздалегідь просочують певними розчинами, висушують, нарізають вузькими смужками довжиною 5 - 6 см. І після посіву культури на МПБ поміщають під пробку між нею і стінкою пробірки. Після інкубації в термостаті враховують результат. Аміак викликає посиніння лакмусового папірця; при виділенні сірководню на папірці, просоченої 20% розчином свинцю ацетату і натріюгідрокарбонату, відбувається утворення свинцю сульфату - папірець чорніє; індол викликає почервоніння папірці, просоченої розчином щавлевої кислоти.

Крім зазначених середовищ, здатність мікроорганізмів розщеплювати різні поживні субстрати визначають за допомогою паперових дисків, просочених певними реактивами (системи індикаторні паперові «СІБ»). Ці диски опускають в пробірки з досліджуваної культурою і вже через 3 год інкубації в термостаті при 37 ° С по зміні кольору дисків судять про розкладанні вуглеводів, амінокислот, білків і т. Д.

Гемолітичні властивості (здатність руйнувати еритроцити) вивчають на середовищах з кров'ю. Рідкі середовища при цьому стають прозорими, а на щільних середовищах навколо колонії з'являється прозора зона. При утворенні метгемоглобіну середу зеленіє.

ЗБЕРЕЖЕННЯ КУЛЬТУР

Виділені і вивчені культури (штами), що представляють цінність для науки або виробництва, зберігають в музеях живих культур. Загальносоюзний музей знаходиться в Державному НДІ стандартизації та контролю медичних біологічних препаратів ім. Л. А. Тарасевича (ГИСК).

Завдання зберігання - підтримати життєздатність мікроорганізмів і попередити їх мінливість. Для цього треба послабити або припинити обмін в мікробної клітці.

Один з найбільш досконалих методів тривалого збереження культур - лиофилизация - висушування у вакуумі із замороженого стану дозволяє створити стан анабіозу. Висушування проводять в спеціальних апаратах. Зберігають культури в запаяних ампулах при температурі 4 ° С, краще при -30-70 ° С.

Відновлення висушених культур.

Сильно нагрівають кінчик ампули в полум'я пальника і торкаються до нього ватним тампоном, злегка змоченим холодною водою, щоб на склі утворилися мікротріщини, через які повітря повільно просочиться всередину ампули. При цьому, проходячи через розігріті краї тріщин, повітря стерилізується.

Не забувайте, що в запаяній ампулі вакуум. Якщо повітря в неї потрапляє відразу через великий отвір, може розпорошитися знаходиться в ампулі культура і статися її викид.

Давши увійти повітрю, швидко пінцетом надламують і видаляють верхівку ампули. Злегка обпалюють отвір і стерильною пастерівською піпеткою або шприцом вносять в ампулу розчинник (бульйон або ізотонічний розчин). Перемішують вміст ампули і засівають на середовища. Зростання відновлених культур в перших посівах може бути сповільнений.

Тривало зберігати культури Можна також в рідкому азоті (-196 ° С) в спеціальних приладах.

Методи нетривалого збереження культур наступні: 1) субкультівірованія (періодичні пересівання на свіжі середовища) з інтервалами, що залежать від властивостей мікроорганізму, середовища і умов культивування. Між пересіву культури зберігають при 4 ° С; 2) збереження під шаром масла. Культуру вирощують в агарі стовпчиком висотою 5-6 см, заливають стерильним вазеліновим маслом (шар масла приблизно 2 см) і зберігають вертикально в холодильнику. Терміни зберігання у різних мікроорганізмів різні, тому з пробірок періодично висівають культуру, щоб перевірити її життєздатність; 3) зберігання при -20-70 ° С; 4) зберігання в запаяних пробірках. При необхідності зберігається матеріал висівають на свіжу середу.

Глава 8. фаги

Фаги - віруси бактерій і ряду інших мікроорганізмів. У певних умовах вони викликають лізис (розчинення) своїх господарів. Дія фагів проявляється в природі і використовується в практиці.

Ріс.42 Бактеріофаги

Історія відкриття і вивчення фага. У 1898 р Н. Ф. Гамалія показав, що фільтрат сибіркових бацил викликає лізис свіжих культур цих мікроорганізмів, У 1915 р Ф. Ту орт виявив, що білі непрозорі колонії стафілококів ставали прозорими і зникали і що агент, лізуючий стафілококи, проходить через бактеріальні фільтри, зберігаючи здатність розчиняти свіжі культури мікроорганізмів. Явище лізису мікроорганізмів було описано, але природа його не вивчена. Ось чому честь відкриття бактеріофага належить канадському вченому д "Ереллю.

Д "Ерелль (1917) вивчав фільтрати випорожнень, які брав щодня у хворого на дизентерію і вносив в пробірки зі свежезасеянной культурою збудника цієї хвороби. Після інкубації в термостаті культура виростала. Але одного разу вона не виросла, а розчинилася. Це збіглося з початком одужання хворого.

Д "Ерелль показав, що лізуючого здатність фільтратів випорожнень посилювалася при послідовних пасажах на свіжих культурах бактерій. З цього вчений зробив висновок, що розчиняє їх живої агент, що проходить через бактеріальні фільтри, т. Е. Вірус. В даний час його точка зору прийнята більшістю вчених.

Відкритий вірус д "Ерелль назвав бактеріофагом- пожирачів бактерій (від грец. Фагосом -пожірающій), а явище - бактеріофаги.

З відкриттям електронного мікроскопа була підтверджена корпускулярна природа фага і вивчена його морфологія.

Відкриття д "Ерелля привернуло увагу лікарів, які застосували фаг для лікування і профілактики ряду інфекційних хвороб. В даний час фаги широко використовують в медичній практиці і при різних біологічних дослідженнях. Фагами займаються бактеріологи, вірусологи, біохіміки, генетики, біофізики, молекулярні біологи, експериментальні онкологи , фахівці з генної інженерії і біотехнології і т. д. Вивчення фага триває, як одна з найцікавіших глав біології.

властивості фагів

Морфологія фагів. Більшість фагів складається з головки і хвостового відростка, тому їх порівнюють з пуголовками або сперматозоїдами. Найбільш вивчені Т-фаги кишкової палички). Їх відросток являє собою порожнистий циліндр (стрижень), покритий чохлом і закінчується базальної платівкою з шипами і фибриллами. Розміри фагів, форма і величина головки, довжина і будова відростка різні в різних фагів. Наприклад, зустрічаються фаги з довгим відростком, чохол якого не скорочується, фаги з коротким відростком, без відростка і ниткоподібні

Хімічний складфагів. Як і всі віруси, фаги складаються з нуклеїнової кислоти одного типу (частіше зустрічаються ДНК-фаги) і білка. Молекула нуклеїнової кислоти, скручена в спіраль, знаходиться в голівці фага. Оболонка фага (капсид) і відросток мають білкову природу. На вільному кінці відростка міститься литический фермент, зазвичай лізоцим або гіалуронідаза.

Взаємодія фага з чутливою клітиноюпроходить через послідовні стадії. Весь цикл займає в різних системах фаг -бактерія від декількох хвилин до 1-2 ч. Розберемо послідовність цього процесу на прикладі Т-парного фага кишкової палички.

Стадія I - адсорбція частинок фага на поверхневих рецепторах клітини здійснюється за допомогою ниток хвостового відростка. На одній клітці можуть адсорбуватися сотні фагів (для лізису клітини досить одного). Адсорбція фагів специфічна.

Стадія II - проникнення (ін'єкція) нуклеїнової кислоти фага в клітини у різних фагів відбувається по-різному. У Т-фагів кишкової палички шипи базальної пластинки стикаються з клітинною стінкою. Стрижень «проколює» клітинну стінку. Фермент, що знаходиться в відростку, найчастіше лізоцим, руйнує цитоплазматичну мембрану. При цьому чохол відростка скорочується, і через канал стрижня нуклеїнова кислота фага «впорскується» в клітку. Порожня білкова оболонка фага ( «тінь») залишається зовні.

Стадія III - репродукція білка і нуклеїнової кислоти фага всередині клітини.

Стадія IV - складання та формування зрілих частинок фага.

Рис.43 Будова фага.

1 - головка; 2 - ДНК; 3 - стержень; 4 - чохол; 5 - базальна пластинка; 6-шипи; 7 - хвостові фібрили.

Ріс.44 Морфологія фагів.

1 фаги з головкою, відростком і скорочується чохлом; 2 - головка і відросток, без скорочувальної здатності; 3 - головка і короткий відросток; 4 -бесхвостие фаги; 5 - ниткоподібні фаги.

Стадія V-лізис клітини і вихід зрілих частинок фага з неї. Зазвичай відбувається розрив клітинної стінки і в навколишнє середовищевиходить кілька сот нових фагів, здатних вражати свіжі клітини. Такий лизис називається лізисом зсередини.

На відміну від лізису зсередини лизис ззовні відбувається тоді, коли на клітці адсорбується відразу дуже велику кількість фагів. Вони проробляють в клітинної стінкичисленні отвори, через які витікає вміст клітини. Таким чином, при лизисе ззовні фаг не розмножується, і кількість його часток не збільшується.

За характером дії на мікроорганізми розрізняють вірулентні і помірні фаги.

Вірулентні фаги викликають лізис зараженої клітини з виходом у навколишнє середовище великої кількості фагових частинок, здатних вражати нові клітини. При цьому культура мікроорганізмів лизируется. Рідке середовище стає прозорою - відбувається утворення фаголізатов - середовища, в якій знаходиться велика кількість фагів. При розвитку вирулентного фага в бактеріях, що ростуть на щільному середовищі, утворюються або прозорі ділянки суцільного лізису, або виростають окремі прозорі освіти - колонії фага. Їх називають негативними колоніями (бляшками). Колонії - різних фагів відрізняються за величиною і структурою.

Помірні фаги лизируют не всі клітини в популяції. З частиною з них фаги вступають в симбіоз: нуклеїнова кислота фага (його геном) вбудовується в хромосому клітини і отримує назву про Фаг. Відбувається утворення єдиної хромосоми. Бактеріальна клітина при цьому не гине. Профаг, що став частиною генома клітини, при її розмноженні може передаватися необмеженому числу нащадків, т. Е. Новим клітинам. Явище симбіозу мікробної клітини з помірним фагом (профагом) носить назву л і з о г е н і я, а культура, в якій є про фаг, називається лізогенной. Ця назва відображає здатність профага спонтанно покидати хромосому клітини і, переходячи в цитоплазму, перетворюватися в отруйний фаг. Ті клітини культури, в яких утворився отруйний фаг, гинуть (лизируются), інші зберігають Лізогенія.

Схема основних етапів взаємодії фага з бактеріальною клітиною.

1 - впровадження нуклеїнової кислоти фага в клерку; 2-молоді, що розмножуються

фаги; 3 -зрелие фаги; 4 - виділення фагів.

Лізогенія культури за своїми основними властивостями не відрізняються від вихідних, але вони стійкі до повторного зараження однойменною фагом. При дії на Лізогенія культуру проникаючого випромінювання (певних доз і експозиції рентгенівських, космічних променів), деяких хімічних речовині ряду інших чинників продукція вирулентного фага і лізис їм клітин культури значно збільшуються.

Помірні фаги можуть принести шкоду мікробіологічному виробництва. Наприклад, якщо штами-продуценти вакцин, антибіотиків та інших біологічних речовинвиявляються Лізогенія, існує небезпека переходу помірного фага в отруйний, що спричинить за собою лизис виробничого штаму.

Помірні фаги є потужним фактором мінливості мікроорганізмів. Профаг може змінити деякі властивості мікробної культури, наприклад зробити її здатною до токсінообразованію, що спостерігається серед дифтерійних паличок, збудника скарлатини та ін. Крім того, переходячи в вірулентну форму і лізіруя клітку, фаг може захопити частину хромосоми клітини-господаря і перенести цю частину хромосоми в іншу клітку, де фаг знову перейде в профаг, а клітина отримає нові властивості.

Поширення фагів в природі повсюдне. Фаги зустрічаються там, де знаходяться чутливі до них мікроорганізми: у воді, ґрунті, стічних водах, Виділених людини і тварин і т. Д. Майже всі відомі бактерії є господарями специфічних для них фагів.

Стійкість фагів до фізичних і хімічних факторів вище, ніж у вегетативних форм їх господарів. Фаги витримують нагрівання до.75 ° С, тривалий висушування, рН від 2,0 до 8,5. Вони не чутливі до антибіотиків, тимолу, хлороформу і ряду інших речовин, що знищують супутню мікрофлору. Тому ці речовини використовують при виділенні і збереженні фагів. Кислоти та дезинфікуючі речовини згубні для фагів.

Практичне застосування фагів

Застосування фагів базується на їх суворої специфічності і здатності руйнувати мікробні клітини або вступати з ними в симбіоз.

Фагопрофілактика і фаготерапія-попередження і лікування інфекцій за допомогою фагів засновані на тому, що, зустрічаючи в організмі хворого збудника хвороби, фаг знищує його. В даний час фаги широко застосовують при лікуванні і профілактиці стафілококових і стрептококових уражень, навіть таких, які не піддаються дії антибіотиків, а також холери, чуми і ряду інших інфекцій, наприклад, інфекцій, викликаних кишковою паличкою і протеєм.

Фагодіагностіка включає: а) ідентифікацію виділених культур за допомогою відомих (діагностичних) фагів. Культура відповідає тому фагу, який її лізис. Наприклад, якщо лизис викликав холерний фаг, то це культура холерного вібріона. Сувора специфічність типових фагів дає можливість типировать варіанти всередині виду (фаговари). Фаготіпірованіе має велике значення в епідеміології, так як дозволяє встановити джерело інфекції і вирішити ряд інших питань; б) визначення невідомого фага по тест-культурі мікробів. Якщо фаг лизирует культуру збудника дизентерії, то це дизентерійний фаг; в) прискорений метод діагностики за допомогою реакції наростання титру фага РНТФ не вимагає виділення чистої культури збудника. Досліджуваний матеріал (від хворого або з об'єктів зовнішнього середовища) і індикаторний фаг, титр якого строго встановлений, вносять в бульйон.

Помірні фаги широко застосовують при вирішенні кардинальних питань біології. З їх допомогою вивчений генетичний код, досягнуті великі успіхив генній інженерії, їх використовують для вивчення пухлинного росту, як фактор мінливості мікроорганізмів і в інших дослідженнях. Так як Лізогенія культури на відміну від «здорових» чутливі до радіації, вони служать для визначення надійності захисту космічних кораблів від космічних променів: при ненадійною захисту профаг переходить в вірулентну форму і лизирует культуру.

ПРЕПАРАТИ фагів

При виробничому отриманні препаратів фага користуються добре вивченими штамами мікроорганізмів і фагів, які зазвичай вирощують в реакторах, що дозволяє отримувати великі кількостіфаголізатов.

Фаги випускають в рідкому вигляді (ампули і флакони), в таблетках і свічках. Пігулка фагів, призначені для застосування через рот, покриті кислотостійкої оболонкою, що захищає фаги від дії соляної кислоти шлункового соку.

Всі препарати фагів підлягають обов'язковому контролю на відсутність сторонньої флори, нешкідливість і активність (титр), який здійснюється на випускає їх виробництві. Вибірковий контроль проводять в Державному НДІ стандартизації та контролю медичних біологічних препаратів ім. Л.А. Тарасевича. Що випускається фаг забезпечений етикеткою, на якій вказано: установа, його випускає, назва фага, серія, номер контролю і термін придатності. Кожна упаковка забезпечена інструкцією з застосування і зберігання фага.

У багатьох випадках справжнє молярное кількість ферменту невідомо. Тому прийнято про кількість ферменту судити по швидкості реакції, яку він каталізує в певних умовах вимірювання. Визначення активності ферменту - це непряме визначення його кількості, так як швидкість ферментативної реакції пропорційна концентрації діючої ферменту.

За рішенням Комісії з ферментам Міжнародного біохімічного союзу (1961) за міжнародну одиницю активності ферменту приймається таке його кількість, яке каталізує перетворення 1 мікромоля субстрату в одну хвилину при 30 ° С (мкмоль / хв). Питому активність виражають в одиницях активності ферменту на 1 мг білка або на 1 мг препарату.

Згідно з міжнародною системою заходів (1972) рекомендована нова міжнародна одиниця активності ферменту - катав. Катав відповідає кількості ферменту, здатному викликати перетворення 1 моль субстрату в продукт в одну секунду (моль / с).

Ставлення колишньої одиниці активності ферменту до ка- Талу становить мкмоль / хв - 60 мкмоль / с - 16,67 нмоль / с. Отже, одиниця активності ферменту відповідає 16,67 нкат.

Нормальне функціонування органів і тканин організму є відображенням координованого функціонування всіх регуляторних систем, включаючи ферментні. Можна вважати, що зміна активності одного ферменту або його відсутність призводить до порушення сталості метаболізму. При будь-якої етіології хвороби, інфекційної або інвазивної, виникають зміни активності ферментних систем, і в цьому сенсі всі хвороби розглядаються як метаболічні.

Унаслідок порушень певних ферментних систем в організмі виявлено багато хвороб тварин і людини. Так, відомі анемії, викликані недоліком в еритроцитах піруваткінази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, метге- моглобінредуктази. Часто патогенез патологічного процесу нелегко визначити. Щоб з'ясувати, яка ферментна система порушена, слід вивчити багато факторів; необхідна тканинна біопсія, вибір відповідних діагностичних реакцій, активаторів або інгібіторів ферменту.

Необхідність визначення активності сироваткових ферментів заснована на припущенні, що зміни їх активності відображають зміни, що відбуваються в певному органі. Можна виявити в сироватці ферменти двох типів: один є специфічним для сироватки, виконуючи конкретну роль, тоді як інший тип ферменту зазвичай присутній в сироватці в дуже низькій концентрації і не несе певної функції.

При ряді патологій (інсульт) можливі зміни клітинної проникності та збільшення числа зруйнованих клітин, що призводить до виходу внутрішньоклітинних ферментів в плазму. У цих випадках першими в плазмі виявляються ферменти низькою молекулярної маси.

В діагностиці патології окремого органу було б ідеально визначити активність ферменту, характерного для даного органу. Однак це неможливо здійснити, оскільки метаболізм в різних органах протікає однаково. І все ж можна встановити тканинні або органоспецифічні ферменти, активність яких відображає функцію певних тканин або органів. Наприклад, підвищення активності кислої фосфатази в крові характеризує наявність пухлини простати; підвищення активності лактатдегідрогенази і креатінфосфо- кінази в сироватці крові є дуже інформативним діагностичним тестом, який відображає пошкодження серцевого м'яза. Збільшення активності ізоферментів ЛДГ ^ і ЛДГ 2 в сироватці крові вказує на інфаркт міокарда, підвищення активності ЛДГ і аспартатамінотрансферази свідчить про розпад клітинних елементів в кістковому мозку. Зв'язок між активністю ферментів і патологічним процесом не завжди можна зрозуміти, але ці дані, безсумнівно, мають великий клінічний інтерес.