Методична розробка на тему: Методичні рекомендації з практичних та лабораторних робіт навчальної дисципліни "Основи мікробіології, санітарії та гігієни у харчовому виробництві". Практикум з мікробіології

Методичні рекомендації

з виконання практичних робіт

для професії:

19.01.17 Кухар. Кондитер

Розробник:

Веретеннікова О.М. викладач

Валуйки, 2016

Пояснювальна записка

Дані методичні вказівки для виконання практичних робіт з дисципліниоснови мікробіології, санітарії та гігієни у харчовому виробництві » були розроблені на основі Федерального державного освітнього стандарту (далі – ФГОС) за фахом:

19.01.17 Кухар. Кондитер

Методичні вказівки для виконання практичних робіт призначені для студентів першого курсуВиконання практичних та лабораторних робіт спрямоване на вирішення наступнихзавдань:

підвищити усвідомлення та міцність засвоєння знань;

розвивати вміння аналізувати, порівнювати об'єкти, що вивчаються, проводити дослідження, складати таблиці, схеми, кластери, робити висновки;

розвивати в учнів логічне мислення, пізнавальні здібності, Самостійність;

навчити використовувати отримані знання та вміння в житті.

При вивченні, закріпленні матеріалу використовуються такі типи самостійних робіт:

Робота із текстом підручника.

Робота із презентацією.

Робота з об'єктом, що вивчається.

Робота з таблицею.

Робота зі складання кластера, схеми.

Робота із готовими мікропрепаратами. Приготування мікропрепаратів.

Структура методичних вказівок:

1. тема
2. мета роботи
3. обладнання для виконання робіт
4. хід роботи
5. контроль та актуалізація знань студентів, необхідних для виконання роботи
6. умови виконання роботи

Кожна практична та лабораторна робота має бути оформлена у зошиті для практичних робіт відповідно до рекомендацій. (Додаток 1)

Контроль результатів виконаних робіт здійснюється на підставі письмового звіту та результатів спостереження за учням під час виконання роботи відповідно докритеріями оцінок виконання практичної роботи.

Перелік практичних робіт

Практична робота №1

Влаштування мікроскопа та правила роботи з ним.

Практична робота №2 Вивчення під мікроскопом морфології дріжджів та плісняви

Практична робота № 3 Схеми будови клітин бактерій, дріжджів, грибів.

Практична робота № 4-5

Практична робота № 6Схеми приготування дезінфікуючих розчинів та їх зберігання

Практичні завдання, спрямовані на перевіркуумінь учнів застосовувати теоретичні знання з дисципліни на практиці

Практична робота №1 ПРИСТРІЙ МІКРОСКОПА І ПРАВИЛА РОБОТИ З НИМ.

Мета роботи: Вивчити пристрій світлового біологічного мікроскопа та освоїти правила роботи з ним.

Обладнання, матеріали: мікроскоп; готові мікропрепарати

Мікроскоп (Від грец.micros– малий таscopio– дивлюсь) – це оптичний прилад, що складається з трьох основних частин: механічної, оптичної та освітлювальної.

Схема світлового біологічного мікроскопа представлена ​​рис. 1.

Механічна частина або штатив складається з ніжки, основи, тубусоутримувача, предметного столика, монокулярної насадки (тубуса), револьверного пристрою, рукоятки грубого фокусування (макрометричного гвинта), рукоятки тонкого фокусування (мікрометричного гвинта).

Тубус – зорова труба мікроскопа. У верхній отвір тубуса вільно вставляється окуляр, на нижньому кінці тубуса знаходиться револьверний пристрій (револьвер), що обертається навколо своєї осі, в яке загвинчуються об'єктиви. Повертаючи револьвер, можна швидко змінити об'єктиви під час роботи з мікроскопом, підводячи будь-який об'єктив під тубус. Об'єктив може бути центрований, тобто. встановлений на оптичну вісь мікроскопа. Для цього револьвер повертають довкола своєї осі до появи клацання.

Предметний столик служить розміщення у ньому досліджуваного препарату. Препарат закріплюють на столику затискачами (клеммами). У центрі предметного столика знаходиться отвір для проходження променів світла та освітлення препарату. У деяких конструкціях мікроскопа предметний столик може пересуватися за допомогою гвинтів, розташованих на периферії предметного столика. Це дає можливість розглянути препарат у різних полях зору.

1 – окуляр

2 – монокулярна насадка

(Тубус)

3 - Револьверний пристрій

4 - об'єктив

5 – предметний столик

6 - конденсор

7 – корпус колекторної лінзи

8 – патрон із лампою

9 - шарнір

10 – рукоятка переміщення кронштейна конденсора

11 – рукоятка тонкого фокусування (мікрометричний гвинт)

12 – рукоятка грубого фокусування (макрометричний гвинт)

13 - тубусоутримувач

14 – гвинт для кріплення насадки

Мал. 1Схема влаштування світлового біологічного мікроскопа

Рукоятки грубого і тонкого фокусування (макро- та мікрогвинти) служать для переміщення тубуса вгору і вниз, що дозволяє встановити його на потрібній відстані від препарату. При обертанні гвинтів за годинниковою стрілкою тубус опускається, а при обертанні проти годинникової стрілки піднімається. При обертанні макрометричного гвинта об'єктив орієнтовно встановлюється фокус, тобто. на ту відстань від препарату, при якому він стає видимим. Оборот макровинта дозволяє перемістити тубус на 20 мм. Мікрометричний гвинт служить для точного встановлення на фокус. Повний оберт його переміщає тубус на 0,1 мм. З мікрогвинтом слід поводитися дуже обережно: допустимо обертання мікрогвинта не більше ніж на 180 0 З у той чи інший бік.

Оптична частина є найціннішою частиною мікроскопа. Вона складається з об'єктивів та окуляра.

Окуляр (від лат.oculus– око) складається з двох плоскопуклих лінз, укладених у загальну металеву оправу. Верхня лінза - очна (збільшує), нижня - збирає. Відстань між лінзами дорівнює напівсумі їх фокусної відстані. У окулярів з великим збільшенням фокус коротший, тому менша і довжина окуляра. Між лінзами є діафрагма, що обмежує поле зору та затримує крайові промені світла. Вітчизняні мікроскопи забезпечені трьома змінними окулярами, збільшення яких вказано на корпусі окуляра (х7; х10; х15).

Об'єктиви вкручуються в гнізда револьверного пристрою і складаються із системи лінз, укладених у металеву оправу. Передня (фронтальна) лінза об'єктива є найменшою та єдиною, що дає збільшення. Інші лінзи в об'єктиві лише виправляють недоліки отриманого зображення (яви сферичної та хроматичної аберації) і називаються корекційними.

У гнізда револьверного пристрою вкручуються чотири об'єктиви, збільшення яких вказано на корпусі об'єктива (х8; х20; х40; х90 або 100). Кожен об'єктив характеризується своєю фокусною відстанню (відстанню між предметним склом та фронтальною лінзою): об'єктив х8 має фокусну відстань близько 9 мм, об'єктив х40 – 0,65 мм, об'єктив х90 – 0,15 мм.

Освітлювальна частина Мікроскоп складається з дволінзового конденсора, ірис-діафрагми і патрона з низьковольтною лампочкою розжарювання, що живиться через понижувальний трансформатор від мережі напруги 120 ... 220 В.

Конденсор служить для кращого висвітлення препарату. Він збирає світлові промені в пучок і спрямовує їх через отвір предметного столика на препарат. За допомогою рукоятки для переміщення кронштейна конденсора його можна переміщати вгору та вниз, завдяки чому змінюється кут збіжності променів і, отже, ступінь освітлення об'єкта. Чим вище становище конденсора, тим краще освітлений препарат.

Ірис-діафрагма розташовується під конденсором і служить для регулювання потоку світла, що надходить у конденсор. Вона складається із металевих серповидних пластинок. Розширити або звузити отвір діафрагми можна за допомогою спеціального важеля. При обертанні його за годинниковою стрілкою отвір ірис-діафрагми збільшується і, отже, збільшується ступінь освітлення об'єкта.

При роботі з імерсійними об'єктивами ступінь освітлення препарату має бути максимальним, тому шторку ірис-діафрагми відкривають, а конденсор піднімають у крайнє верхнє положення.

Працюючи з сухими об'єктивами, зазвичай, розглядають незабарвлені об'єкти. Для досягнення контрастності конденсор опускають донизу, а отвір ірис-діафрагми зменшують.

Правила роботи з мікроскопом

На робочому столі мікроскоп ставлять тубусодержателем до себе з відривом 3…5 див від краю столу;

Включають мікроскоп у мережу та встановлюють правильне освітлення

На предметний столик поміщають досліджуваний препарат та закріплюють його клемами;

Під тубус поміщають потрібний об'єктив і за допомогою макро та мікрогвинтів встановлюють фокусну відстань. Так, при роботі з імерсійними об'єктивами на препарат попередньо наносять краплю імерсійної олії та обережно опускають тубусодержатель макровінтом до зіткнення зі склом. Потім, уважно дивлячись в окуляр, дуже повільно піднімають тубусоутримувач, обертаючи його проти годинникової стрілки, доки не побачать зображення. Точне наведення об'єктива на фокус роблять мікрометричним гвинтом. Працюючи з сухими об'єктивами препарат спочатку розглядають з об'єктивом х8. Піднімаючи за допомогою макрогвинта тубусоутримувач і уважно дивлячись в окуляр, встановлюють фокусну відстань (близько 9 мм) і досягають чіткості зображення, використовуючи мікрометричний гвинт. Далі, рухаючи предметний столик або предметне скло, встановлюють в центр поля ту ділянку препарату, в якому найкраще видно об'єкт, що вивчається. Потім, обертаючи револьверний пристрій навколо осі, під тубус поміщають об'єктив на х20 або х40. При цьому під тубус не має потрапити об'єктив х90. У револьверному пристрої об'єктиви розташовуються таким чином, що якщо знайдено зображення з об'єктивом х8, то при розгляді препарату з більшими об'єктивами потрібно злегка підрегулювати чіткість зображення за допомогою макро- і мікрометричних гвинтів;

Під час мікроскопування необхідно тримати обидва очі відкритими та користуватися ними поперемінно;

Після закінчення роботи слід прибрати препарат з предметного столика, опустити вниз конденсор, поставити під тубус об'єктив х8, видалити м'якою тканиною або марлею, змоченою у спирті, імерсійну олію з фронтальної лінзи об'єктива х90, під об'єктив покласти марлеву серветку, опустити тубусоутримувач.

Яким є пристрій біологічного мікроскопа?

З яких частин та механізмів складається механічна частина мікроскопа?

Що становить оптичну систему мікроскопа?

Що входить до складу освітлювальної системи мікроскопа?

Як налаштувати освітлювальну систему під час роботи з імерсійним об'єктивом?

Перелічити основні правила роботи із мікроскопом.

Умови виконання завдання
1. Місце (час) виконання завдання
Кабінет біології

Практична робота №2 Вивчення під мікроскопом морфології дріжджів та плісняви.

Мета роботи : Ознайомитись з морфологічними особливостями грибів та дріжджів, що зустрічаються при виробництві харчових продуктів. Освоїти техніку мікроскопічного дослідження грибів та дріжджів у препаратах «роздавлена ​​крапля».

Обладнання, матеріали: мікроскоп; препарувальні голки, предметні та покривні скла; фільтрувальний папір; спиртування; культури грибів пологівMucor, Aspergillus, Penicillium, Alternaria; чиста культура дріжджівSaccharomycescerevisiae.

1. КОРОТКІ ТЕОРЕТИЧНІ ПОЛОЖЕННЯ

1. 1. Морфологія та культуральні ознаки мікроскопічних грибів

Вегетативне тіло грибів називаєтьсяміцелієм . Міцелій складається з безлічі ниток-трубочок, що переплітаються.гіфами . Діаметр гіфів коливається від 5 до 50 мкм. Залежно від будови міцелію гриби поділяються на вищі та нижчі. У вищих грибів гіфи розділені перегородками (септами) у яких є велика пора. Вони ростуть і при цьому відбуваються поділу ядер, але не відбувається клітинних поділів. Таким чином, вегетативне тіло гриба є однією великою багатоядерною клітиною. Всі мікроскопічні гриби можуть вегетативно розмножуватися шматочком міцелію.

При безстатевому розмноженні у фікоміцетів утворюютьсяспорангієносці , а в аскоміцетів -конідіоносці .

Культуральні ознаки мікроскопічних грибів

Колонії мікроскопічних грибів за розмірами у багато разів перевершують колонії одноклітинних організмів (бактерій, грибів) і нерідко розростаються по всій поверхні живильного середовища у чашках Петрі. Консистенція грибних колоній різна. Найчастіше утворюються повстяні та шкірясті колонії, рідше крихіті. Поверхня колоній може бути пухнастою, як вата, бархатистою, борошнистою, павутиноподібною, ниткоподібною, шкірястою або гладкою. При зростанні на щільних та рідких середовищах частина гіфів вростає в живильне середовище, утворюючисубстратний міцелій, а інша частина гіфів утворюєповітряний міцелій у вигляді пухнастого нальоту, видимого неозброєним оком. Міцелій може бути безбарвним (білим, сіруватим) або пофарбованим (чорним, бурим, зеленим, жовтим і т.д.). Пігментований тільки плодоносний міцелій.

Характеристика мікроскопічних грибів різних класів

Морфологічні особливості грибів різних класів представлені на рис. 5.

РідMucor . Вони можуть розмножуватися безстатевим та статевим шляхом з утворенням спорангієносців (рис. 5). Зовні спорангій покритий тонкими шипами із кристалів щавлевокислого кальцію. При дозріванні спорангій розривається, спорангієспори вивільняються і розносяться повітряними потоками. На спорангієносці після звільнення спорангія від суперечок залишається колонка, а в нижній її частині – комір. Колір міцелію мукорових грибів спочатку білий, потім сірувато-оливковий, вид - повстяний.

а

б

в

г

Мал. 5Морфологічні особливості грибів різних класів:

а - Mucor; б - Penicillium; в - Aspergillus; г - Alternaria

Мукорові гриби ростуть на поверхні вологого зерна, солоду, коренеплодів, на харчових продуктах, на стінах сирих приміщень у вигляді сірого пухнастого нальоту.Mucornigricansє збудником кагатної гнилі цукрових буряків. Багато мукорових грибів використовуються в промисловості для виробництва різних органічних кислот і спирту (гриби видівMucorjavanicus, Mucorracemosus), ферментних препаратів, каротиноїдів, стероїдів.

Представники пологівAspergillus і Penicillium відносяться до класу аскоміцетів, який поєднує вищі мікроскопічні скоєні гриби. При безстатевому розмноженні за допомогою спор ці гриби утворюють конідієносці (рис. 5). Аспергіли та пеніцили відносяться до плодосумчастих грибів. Це означає, що при статевому розмноженні вони спеціальних плодових тілах утворюються аски (сумки), у яких перебувають 8 аскоспор.

До родуPenicillium відноситься близько половини всіх цвілевих грибів. Вони широко поширені в грунті, в повітрі погано провітрюваних приміщень і викликають псування різних продуктів та матеріалів. Цей гриб має септований міцелій, що гілкується (діаметр гіфів – 2…3 мкм) і септовані конідіоносці (нагадують пензлики), які на кінці розгалужуються у вигляді відростків – стеригм. Від них відходять конідії, що складаються з ланцюжків суперечка. Залежно від виду конідії можуть бути різного кольору (білі, зелені та ін.). Багато пеніцилів використовуються в промисловості для отримання різних цінних продуктів. Серед виділених штамів цього роду 25% мають антибіотичну активність, а такі види якPenicilliumnotatum, Penicilliumchrysogenumвикористовуються як продуценти пеніциліну. Деякі види пеніцилів використовуються як продуценти ферментів та ліпідів. У виробництві м'яких сирів рокфор та камамбер використовуються благородні плісняви.PenicilliumroquefortiіPenicilliumcamamberti.

Гриби родуAspergillus налічують понад 200 видів. Ці гриби мають добре розвинений міцелій, що гілкується, з численними септами. Конідієносці несептовані, верхні кінці грудоподібно або кулясто розширені у вигляді невеликої головки. На головці розташовуються кеглеподібні стеригми з ланцюжками конідій, які нагадують струмки води, що виливаються з лійки. Звідси виникла назва «лійкова пліснява» (aspergereлатиною – поливати, обприскувати). Конідії аспергіл при дозріванні набувають різного забарвлення, що поряд з іншими ознаками визначає їх видову приналежність.

Так само як і пеніцили, представники родуAspergillusшироко поширені в природі та відіграють важливу роль у мінералізації органічних речовин. Вони викликають пліснявіння багатьох харчових продуктів. Ці гриби є продуцентами багатьох цінних речовин і широко використовуються у промисловості. Так,Aspergillusnigerзастосовують у промисловості для виробництва лимонної кислоти;Aspergillusterreus- ітаконової кислотиAspergillusflavusіAspergillusterricolaутворюють найактивніший комплекс протеолітичних ферментів;AspergillusoryzaeіAspergillusawamoriє найкращими продуцентами амілолітичних ферментів.

Гриби родуAlternaria ставляться до класу недосконалих грибів – дейтероміцетів. Це найвищі гриби. Вони мають септований міцелій та короткі несептовані конідіоносці, на яких знаходяться багатоклітинні конідії грушеподібної або лимоновидної форми (рис. 5). Гриб є збудником чорної гнилі – хвороби коренеплодів та плодів, а також збудником псування харчових продуктів.

Морфологія дріжджів та їх характеристика

Дріжджі – це найвищі одноклітинні гриби. Більшість дріжджів відноситься до двох класів грибів – аскоміцетів та дейтероміцетів.

Дріжджі по відношенню до кисню діляться на факультативні анаероби (в аеробних умовах здійснюють дихання та активно накопичують біомасу, а в анаеробних умовах викликають спиртове бродіння) та аероби.

Морфологічно дріжджі різноманітні. Вони відрізняються один від одного розмірами та формою клітин. Розміри клітин дріжджів залежно від виду варіюють у межах; від 2,5 до 10 мкм у поперечнику та від 4 до 20 мкм у довжину. Морфологічне розмаїття форм дріжджів зображено на рис. 6.

а

б

в

г

д

е

ж

з

Мал. 6Форми дріжджових клітин: а – овальна яйцеподібна;

б – циліндрична; в – апікулятна; лимоноподібна; г – стрілоподібна;

д – трикутна; е – серпоподібна; ж – колбоподібна; з, і - міцелеподібна

Форма та розміри дріжджових клітин залежать від виду, віку, живильного середовища, способу культивування.

Залежно від виду дріжджі вегетативно можуть розмножуватися брунькуванням (так розмножуються дріжджі овальної форми), бінарним розподілом (характерно для дріжджів циліндричної або паличкоподібної форми) або поділом, що брунькуються. Крім вегетативного розмноження, дріжджі – аскоміцети можуть розмножуватись статевим шляхом з утворенням аскоспор.

З дріжджів, що належать до класу аскоміцетів, велике значення мають дріжджі-сахароміцети родуSaccharomyces , які широко використовуються у харчовій промисловості. Головною біохімічною ознакою цих дріжджів є те, що вони зброджують цукри з утворенням етилового спирту та діоксиду вуглецю. Дріжджі, що використовуються в промисловості, називаютьсякультурні дріжджі. Так, у хлібопекарському виробництві та у виробництві спирту використовуються верхові дріжджі родуSaccharomycescerevisiae. Дріжджі видуSaccharomycesminorзнайшли застосування у виробництві житнього хліба та квасу. У пивоварстві використовуються низові дріжджі.Saccharomycescarlsbergensis. Дріжджі-сахароміцети мають овальну форму, вегетативно розмножуються брунькуванням, у несприятливих умовах розмножуються статевим шляхом аскоспорами.

Деякі спорогенні дріжджі єдикими дріжджами . Ці дріжджі так само, як і культурні, здатні здійснювати спиртове бродіння, але, крім спирту, утворюють багато побічних продуктів (таких як альдегіди, вищі спирти, ефіри та ін) і тому погіршують органолептичні показники продукту. Ці дріжджі є шкідниками виробництва різних напоїв (пива, вина, безалкогольних напоїв), а також збудниками псування багатьох харчових продуктів.

Дріжджі - дейтероміцети можуть розмножуватися тільки вегетативним способом. Деякі з цих дріжджів (наприклад, дріжджі родуCandida) використовуються в промисловості для одержання кормового білка, органічних кислот, вітамінів та інших продуктів мікробного синтезу. Дріжджі видуTorulopsiskefirвходять до складу симбіотичної закваски - гриба кефіру. Інші представники недосконалих (аспорогенних) дріжджів є дикими дріжджами і викликають псування багатьох харчових продуктів. До дріжджів-шкідників виробництва відносяться дріжджі пологів.Pichia, Hansenula, Candida, Rhodotorula,Torula, Torulopsis, Mycoderma, Trichosporonта ін Серед аспорогенних дріжджів зустрічаютьсяпомилкові дріжджі які утворюють псевдоміцелій і ростуть на рідких субстратах у вигляді плівок.

1. ПОРЯДОК ВИКОНАННЯ РОБОТИ

На предметне скло трубочкою чи піпеткою наносять велику краплю води;

Відбирають невелику кількість міцелію з пробірки або чашки Петрі, дотримуючись правил асептики.

Міцелій акуратно поміщають у краплю, нанесену на предметне скло та за допомогою двох голок розправляють його у воді;

Препарат накривають покривним склом та злегка притискають. Надлишки води видаляють за допомогою фільтрувального паперу.

Мікроскопують препарат «роздавлена ​​крапля» спочатку з об'єктивом х8, а потім х40 у затемненому полі зору (конденсор опущений, шторка ірис-діафрагми прикрита).

При відборі та мікроскопії препаратів грибів враховують такі рекомендації:

а) гриб роду Mucor . Відбирають чорнувато-сірий пухнастий повітряний міцелій. При мікроскопії звертають увагу на гіфи із заповненими спорами спорангіями та колонки, що утворюються при звільненні спорангія;

б) гриб роду Aspergillus . Відбирають трохи пухнастого міцелію з пофарбованими конідіями, злегка заглиблюючись голкою в живильне середовище. Звертають увагу на несептовані конідієносці;

в) гриб роду Penicillium . При відборі намагаються взяти молодий міцелій (на межі пофарбованого та білого міцелію), заглиблюючись голкою у середу. Звертають увагу на септовані гіфи з пензликами.

г) гриб роду Alternaria . Беруть грибницю у чорних ділянках, заглиблюючись у неї голками. Звертають увагу на септований міцелій, слабо розвинені конідієносці і великі конідії, що мають вигляд округлих або загострених багатоклітинних утворень, що нагадують гранати-лимонки.

При дослідженні дріжджів на предметне скло наносять суспензію дріжджів, накривають покривним склом, надлишки води видаляють фільтрувальним папером. Мікроскопують препарат та об'єктивом х8 та х40.

Оформлення та аналіз результатів досліджень

Коротко конспектують теоретичний матеріал. Замальовують мікроскопічні картини досліджених культур грибів та дріжджів з урахуванням морфологічних особливостей кожного мікроорганізму. Під кожним малюнком підписують латинську назву та збільшення препарату. Описують культуральні властивості грибів, що вивчаються.

Відповісти на контрольні питання

Як готуються препарати мікроскопічних грибів та дріжджів?

Охарактеризуйте морфологічні та культуральні властивості мікроскопічних грибів.

Які гриби використовуються в промисловості для одержання органічних кислот, ферментів, антибіотиків та інших цінних продуктів?

Охарактеризуйте морфологічні властивості дріжджів.

Що таке культурні дріжджі? У яких галузях харчової промисловості вони використовують?

Умови виконання завдання

Кабінет біології

2. Максимальний час виконання завдання: 90 хв

Практична робота №3: ​​Схеми будови клітин бактерій, дріжджів, грибів.

Мета роботи: Вивчити будову клітинибактерій, дріжджів, грибів

Матеріальне забезпечення: інструктивні карти для виконання практичної роботи, підручник, олівці

Завдання 1

Вивчить матеріал підручника. За результатами вивчення:

Замалюйте у зошит будову клітини бактерій, дріжджів та грибів та вкажіть відмітні ознаки

Письменно відповісти на запитання:

1. Яку форму мають клітини бактерій?

2. Які розміри бактерій?

3. Як відбувається розмноження бактерій, швидкість розмноження?

4. Яким чином, і в яких умовах відбувається утворення спор у бактерій?

5. Чи здатні бактерії до самостійного руху?

Зробіть висновок щодо результатів роботи.

Умови виконання завдання

1. Місце (час) виконання завдання

Кабінет біології

2. Максимальний час виконання завдання: 90 хв

Практична робота на тему №4 Робота з нормативно-технічною документацією: СанПіН 2.3.6. 1079-01

Мета роботи: Вивчити санітарні вимоги до влаштування та утримання підприємств громадського харчування

Матеріальне забезпечення: інструктивні карти для виконання практичної роботи, СанПіН 2.3.6. 1079-01

Завдання 1

Вивчить матеріал підручника. СанПіН 2.3.6. 1079-01. За результатами вивчення:

1. Допишіть фрази: Ділянка, де збудовано підприємство громадського харчування, має бути

До виробничих приміщень належать:

Складські приміщення проектуються у ____________________ частини будівлі.

Питна вода за якістю має відповідати

Для очищення повітря використовується вентиляція

Типу.

Усі виробничі приміщення повинні висвітлюватись

Світлом.

Щомісячне прибирання приміщень називається

2. Дайте визначення наступним поняттям:

Дезінфекція це –

Дератизація це –

Дезінсекція це –

3. Використовуючи навчальний матеріал, заповніть таблицю:

Овочевий цех

М'ясний цех

Рибний цех

Гарячий цех

холодний цех

Кондитерський цех

Роздавальна

Умови виконання завдання

1. Місце (час) виконання завдання

Кабінет біології

2. Максимальний час виконання завдання: 90 хв

Практична робота № 5 Робота з нормативно-технічною документацією: СанПіН 2.3.6. 1079-01

Мета роботи : Вивчити санітарні вимоги до обладнання, інвентарю, посуду, тари. Транспортування та зберігання харчових продуктів.

Матеріальне забезпечення : інструктивні карти для виконання практичної роботи, СанПіН 2.3.6. 1079-01

Завдання 1

Вивчить матеріал підручника, СанПіН 2.3.6. 1079-01. За результатами вивчення:

1. Письменно дайте відповідь на запитання:

Що стосується кухонного посуду?

Навіщо маркують посуд?

Що стосується столового посуду?

Які матеріали допускаються для виробництва обладнання та інвентарю

для підприємств комунального харчування?

У чому полягає принципова різниця при миття столового посуду та столових приладів?

2. Перерахуйте правила та вимоги:

2.1. Санітарні правила перевезення напівфабрикатів:

2.2. Санітарні правила зберігання харчових продуктів:

3. Допишіть фрази:

До початку роздачі якість готових страв має

При подачі перші страви та гарячі напої повинні мати температуру

_______ °С, другі страви та гарніри температуру ______ °С, порційні страви

температуру ______ °С, холодні страви та напої ______ °С.

У лікувально-профілактичних та дитячих закладах у зимово-весняний період через нестачу в овочевих стравах ___________________ потрібно збагачувати цим деякі страви.

За якість готової продукції та дотримання правил її відпустки на підприємствах громадського харчування відповідають ________________

Умови виконання завдання

1. Місце (час) виконання завдання

Кабінет біології

2. Максимальний час виконання завдання: 90 хв

Практична робота № 6 Схеми приготування дезінфікуючих розчинів та їх зберігання

Ціль: вивчити найменування дезінфікуючих засобів, способи приготування розчинів, що дезінфікують, залежно від призначення. Приготувати розчин заданої концентрації.

Матеріальне забезпечення : інструктивні карти для виконання практичної роботи, СанПіН 2.3.6. 1079-01, підручник

Завдання 1

Вивчить матеріал навчальної літератури, СанПіН 2.3.6. 1079-01. За результатами вивчення:

1. Відповісти на запитання:

Які розчини належать до дезінфікуючих?

З якою метою застосовують дезінфікуючі розчини?

Які препарати використовують як дезінфектори?

Як розпізнати, що посуд обробляли дезінфекторами?

2. Вивчити схеми приготування та призначення дезінфікуючих засобів. Заповнити таблицю.

3. Приготувати 1л 0,2% розчину хлораміну Б.

4. Зробити висновок за результатами роботи.

Умови виконання завдання

1. Місце (час) виконання завдання

Кабінет біології

2. Максимальний час виконання завдання: 90 хв

Критерії оцінок за виконання практичної роботи:
Оцінка «5» ставиться, якщо :
1. Правильною самостійно визначає мету даних робіт; виконує роботу у повному обсязі з дотриманням необхідної послідовності проведення.
2. Самостійно, раціонально обирає та готує для виконання робіт необхідне обладнання; проводить дані роботи в умовах, що забезпечують отримання найточніших результатів.
3. Грамотно, логічно описує перебіг робіт, правильно формулює висновки; точно та акуратно виконує всі записи, таблиці, малюнки, креслення, графіки, обчислення.
4. Виявляє організаційно-трудові вміння: - підтримує чистоту робочого місця, порядок на столі, економно витрачає матеріали; дотримується правил техніки безпеки під час виконання робіт.
Оцінка «4» ставиться, якщо :
1. Виконує лабораторну роботу повністю відповідно до вимог при оцінюванні результатів на "5", але допускає у обчисленнях, вимірах два - три недоліки або одну негрубу помилку та один недолік.
2. При оформленні робіт допускає неточності у описі ходу дій; робить неповні висновки під час узагальнення.
Оцінка «3» ставиться, якщо :
1.1 Правильно виконує роботу щонайменше, ніж 50%, проте обсяг виконаної частини такий, що дозволяє отримати правильні результати і зробити висновки з основним, принциповим важливим завданням роботи.
2. Підбирає обладнання, матеріал, починає роботу з допомогою викладача; або в ході проведення вимірювань, обчислень, спостережень припускається помилок, неточно формулює висновки, узагальнення.
3. Проводить роботу в нераціональних умовах, що призводить до отримання результатів із великими похибками; або у звіті допускає загалом трохи більше двох помилок (у записах чисел, результатів вимірів, обчислень, складанні графіків, таблиць, схем тощо.), які мають даної роботи принципового значення, але які вплинули результат виконання.
4. Допускає грубу помилку в ході виконання роботи: у поясненні, в оформленні, дотриманні правил техніки безпеки, яку учень виправляє на вимогу вчителя.
Оцінка "2" ставиться, якщо :
1. Не визначає самостійно мету роботи, не може без допомоги викладача підготувати відповідне обладнання; виконує роботу в повному обсязі, і обсяг виконаної частини не дозволяє зробити правильні висновки.
2. Допускає дві і грубіші помилки під час робіт, які може виправити на вимогу педагога; або здійснює вимірювання, обчислення, спостереження невірно.

ДОДАТОК.

Додаток 1

ПАМ'ЯТКА СТУДЕНТУ

За виконання роботи студент зобов'язаний:

Попередньо докладно ознайомитися з теоретичним матеріалом і добре зрозуміти мікробіологічні закономірності та процеси, які слід вивчити практично.

Виконуючи експеримент, дотримуватися всіх запобіжних заходів, послідовність операцій, проводячи необхідні спостереження.

Записати результати досвіду у зошиті за схемою, запропонованою у роботі:

Після закінчення роботи упорядкувати робоче місце і здати його лаборанту або викладачеві.

Транскрипт

1 Міністерство освіти і науки Російської Федерації Федеральне агентство освіти Московський державний університет інженерної екології Кустова Н.А. ЛАБОРАТОРНИЙ ПРАКТИКУМ З МІКРОБІОЛОГІЇ Москва 2005

2 Лабораторний практикумз мікробіології призначений для студентів спеціальностей 3207 та 3302 з дисципліни «Основи мікробіології та біотехнології», а також для студентів кафедри «Екологічна та промислова біотехнологія» з дисципліни «Екологічна та промислова мікробіологія». Практикум складається із трьох розділів. Перший розділ присвячено питанням загальної мікробіології. У роботах цього розділу вивчаються морфологічна будова різних груп мікроорганізмів, методи мікроскопічного дослідження, техніка мікробіологічних посівів, методи стерилізації та методи кількісного обліку мікроорганізмів. Другий розділ містить роботи з використанням мікробів у біотехнології для отримання різних речовин органічних кислот, спиртів, антибіотиків, ферментів. У роботах третього розділу вивчаються питання екологічної мікробіології. Частина робіт показує роль мікроорганізмів у глобальних біогеохімічних циклах, інші присвячені проблемам біотехнологічної охорони. довкілля. Кожна тема містить теоретичне введення та практичну частину, в якій даються опис застосовуваних методів, порядок виконання роботи, зміст звіту щодо роботи, а також контрольні питання. 2

3 ПЕРЕДМОВА Лабораторний практикум з мікробіології призначений для студентів 3 курсу спеціальностей 3207 та 3302 з дисципліни «Основи мікробіології та біотехнології», а також для студентів 4 курсу кафедри «Екологічна та промислова біотехнологія» за спеціалізацією «Біотехнологічний захист навколишнього середовища промислова мікробіологія». В основу Лабораторного практикуму покладено «Методичні вказівки до лабораторних робіт» за ред. П.І.Миколаєва, які використовувалися на кафедрі «Процеси та апарати мікробіологічних виробництв» з моменту створення кафедри. У викладання мікробіології під час навчання інженерів для мікробіологічної промисловості величезний внесок зробила с.н.с., к.б.н. Н.В.Поморцева. Методичні вказівки були підготовлені під її керівництвом науковими співробітниками кафедри: М.А.Боруздіної, І.Є.Ломової, Н.А.Кустової, Т.А.Махоткіної та К.А.Соловйової. Зміна навчальної програмиВідповідно до нової спеціальності інженер-еколог викликало необхідність розширити курс мікробіології та доповнити його завданнями з біотехнологічних методів захисту навколишнього середовища. Лабораторний практикум складається із трьох розділів. Перший розділ присвячено спільній мікробіології: морфології мікроорганізмів, методам її вивчення, техніці мікробіологічних посівів, методам кількісного обліку мікроорганізмів. Другий розділ охоплює деякі приклади використання мікробів у промисловості. Третій розділ висвітлює питання екології мікроорганізмів, їх роль глобальних циклах елементів, соціальній та біотехнологічних методах охорони навколишнього середовища. У складанні цього практикуму взяли участь аспірант кафедри Н.В.Зябрева та с.н.с. Є.С.Горшина. Автор висловлює глибоку подяку доц. кав. мікробіології МДУ М.М. Колотилової за цінні зауваження та поради, а також с.н.с. П.П.Макєєву за допомогу в оформленні тексту та ілюстративного матеріалу. 3

4 4 ЗАГАЛЬНІ ПРАВИЛА РОБОТИ В МІКРОБІОЛОГІЧНІЙ ЛАБОРАТОРІЇ Правила роботи та поведінки в лабораторії Правила роботи та поведінки в мікробіологічній лабораторії мають багато спільного з правилами роботи в хімічних лабораторіях, але мають свою специфіку. Мікробіолог здебільшого працює з чистими культурами мікроорганізмів, тобто. з мікроорганізмами будь-якого одного роду, виду та штаму. Оскільки на всіх навколишніх предметах та в повітрі знаходяться сторонні мікроби, застосовуються спеціальні методи роботи, щоб уникнути зараження досліджуваної культури мікроорганізму або самої людини. Для цього живильні середовища, посуд, інструменти стерилізують, лабораторію та робочі місця містять у чистоті, дотримуються певних правил при роботі з мікробами. У лабораторії не повинно бути зайвих предметів. Слід регулярно проводити вологе прибирання. Різні поверхні лабораторних приміщень періодично дезінфікують. Дезінфекція це знезараження, тобто. знищення збудників інфекційних хвороб на об'єктах довкілля. Для цього використовують 0,5 3% розчин хлораміну або 3 5% розчин фенолу (карболова кислота). Робочий стіл слід дезінфікувати 70% розчином етилового або ізопропілового спирту. Дезінфекція повітря досягається простим провітрюванням (щонайменше хв). Більш ефективний спосіб дезінфекції повітря опромінення приміщення ультрафіолетовими променями за допомогою бактерицидних ламп. Особливо часто ультрафіолетове опромінення застосовується для стерилізації боксу. Бокс спеціальне невелике приміщення для пересівання чистих культур, кількісного обліку мікроорганізмів на чашках Петрі та деяких інших робіт, що потребують особливо чистих умов. Перед роботою бокс опромінюють протягом хв. Стіл протирають спиртом, стіни та підлогу періодично миють. Замість боксу лабораторії можуть оснащуватись ламінарними шафами (рис. 1), які також стерилізуються бактерицидними лампами. При

5 роботі включають вентилятор для створення ламінарного потоку стерильного повітря, пропущеного через бактерицидні фільтри. Основне обладнання мікробіологічної лабораторії включає: мікроскопи, термостати для вирощування мікроорганізмів, апаратуру для стерилізації (автоклав і сушильний шафа), центрифуги, дистилятор, холодильник для зберігання музейних культур мікроорганізмів, шафи для розміщення скляного посуду і реактивів, необхідні прилади. -метри і т.д.). За кожним студентом закріплюють робоче місце, на якому розміщують: мікроскоп, що закривається чохлом, бактеріологічну петлю, предметні та покривні скла, стерильні піпетки, спиртовий пальник, смужки фільтрувального паперу, маркер по склу, посудину з дезінфікуючою рідиною. На столі не повинно бути нічого, що не стосується безпосередньо виконання роботи. На лабораторних заняттях з мікробіології слід дотримуватись правил техніки безпеки. 5

6 6 Коротка інформація з техніки безпеки в лабораторії У мікробіологічній практиці широко застосовується посуд з хімічного скла. Потрібно бути обережними при роботі з нею. Уламки розбитого посуду ретельно прибирати. При аналізах часто застосовуються міцні розчини лугів та кислот. Працювати з ними потрібно з великою обережністю, оскільки ці речовини шкідливо діють на шкіру рук та одяг. Якщо кислота випадково пролилася, її треба засипати великою кількістю соди і кілька разів промити водою. Луж, що пролилася, треба ретельно витерти, а предмети, на які вона потрапила, обробити слабким розчином оцтової кислоти. При попаданні кислот або лугів на шкіру людини їх необхідно відразу ж змити великою кількістю води. У мікробіологічній лабораторії мають справу з живими мікроорганізмами. Основні роботи ведуться стерильно, тобто. працюють із однією культурою мікроорганізмів, яка має заражатися сторонніми мікробами. Для запобігання зараженню посівів застосовують спеціальні методи стерилізації. Крім того, важливо дотримуватися чистоти в лабораторії. Посуд із культурами мікроорганізмів не повинен залишатися відкритим. Біомаса мікроорганізмів, якщо вона не потрібна для аналізів, викидається лише після стерилізації в автоклаві. Посіви мікроорганізмів виробляють у полум'ї газового або спиртового пальника, тому слід остерігатися опіків, і насамперед акуратно підібрати довге волосся. Пальник повинен горіти лише тоді, коли це необхідно. Якщо при посіві випадково спалахне ватяна пробка, спиртовка або папір, вогонь гасять рушником. При більших вогнищах загоряння користуються вогнегасниками. Використані піпетки, предметні та покривні скла, шпателі тощо. поміщають у посудину з рідиною, що дезінфікує. Студенти повинні постійно пам'ятати, що вони мають справу з мікроорганізмами, які далеко не завжди можуть бути безпечними, особливо у роботах із виділення мікробів з об'єктів довкілля. Тому наприкінці заняття студенти повинні упорядкувати робоче місце і вимити руки з милом.

7 При несправності електричної мережі потрібно вимкнути електроприлади та їхнє централізоване електроживлення. РОЗДІЛ 1. ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ ТЕМА 1. Морфологія мікроорганізмів та її вивчення Микробиология вивчає організми, які мають мікроскопічні розміри, тобто. вимірюються мікрометрами чи частками мікрометрів. Один мікрометр дорівнює 10-6 метрів і скорочено позначається мкм. Мікроорганізми характеризуються інтенсивним обміном речовин та здатні здійснювати різноманітні хімічні перетворення. Різні мікроорганізми відрізняються і за своєю будовою та за тими біохімічними процесами, які вони здійснюють. Об'єднання в одну групу викликано як малими розмірами, а й спільністю методів культивування і дослідження. Для вивчення будови мікроорганізмів, їхнього зовнішнього вигляду, форми, розмірів, тобто. вивчення морфології мікроорганізмів, користуються мікроскопом. Найменші частки, які вдається побачити у сучасні світлові мікроскопи, мають величину понад 1/3 довжини хвилі світла, тобто. не менше 0,2 мкм, що пов'язано з використанням видимої частини світла, що має довжину хвилі від 0,4 до 0,7 мкм мкм. Влаштування мікроскопа На рис. 2 показаний зовнішній вигляд поширеного в науково-дослідній та навчальній практиці мікроскопа МБІ-3. Об'єкт, що розглядається, препарат поміщається на предметний столик і висвітлюється знизу променями світла, які виходять з освітлювача, падають на дзеркало, потім проходять через конденсор і фокусується на препараті. Основні частини мікроскопа: окуляри, тубус, револьверна насадка з об'єктивами, предметний столик із затискачами для препаратів, конденсор, макро мікровінти для наведення на різкість і, нарешті, штатив, в який все це вмонтовано. 7

8 Перед мікроскопіюванням перевіряють правильність установки освітлення (за Келером). Для цього, переміщуючи патрон освітлювача з лампочкою, досягають чіткого зображення нитки 8

9 запалення лампи на закритій повністю діафрагмі конденсора так, щоб це зображення повністю заповнювало отвір конденсора. Закривши діафрагму освітлювача, відкривають діафрагму конденсора і, переміщуючи конденсор, досягають різкого зображення діафрагми освітлювача у полі зору мікроскопа. Щоб яскраве світло не зліпило очі, попередньо зменшують напруження нитки лампи. І, нарешті, зображення отвору діафрагми встановлюють у центрі поля зору, а діафрагму освітлювача відкривають так, щоб освітлено все поле зору. Мікроскоп є оптичною системою з двома ступенями збільшення: перше збільшення здійснюється об'єктивом, друге окуляром. Об'єктив дає збільшене зворотне зображення предмета, що у окуляр. Внаслідок очей спостерігача бачить сильно збільшене зворотне зображення предмета. Тому рух об'єкта ліворуч сприймається оком як рух праворуч. Загальне збільшення мікроскопа, тобто. збільшення, у якому розглядають об'єкт під мікроскопом, визначається як добуток збільшення об'єктиву та окуляра. Об'єктиви дають збільшення 10, 40, 60, 90 разів, окуляри в раз. Якщо застосовується бінокулярна насадка, то вона дає додаткове збільшення. На рис. 3 показано принципову схему оптичної системи мікроскопа. Об'єктив О утворює у площині Z дійсне перевернене зображення А об'єкта А. Дане об'єктивом зображення збільшується далі за допомогою окуляра Е. Так як Z знаходиться у фокусі окуляра Е, спостерігач бачить збільшене уявне зображення А в площині Х, яка зазвичай розташовується в 25 см від ока , тобто. на відстані, найбільш зручній для ближнього зору. Слід мати на увазі, що таке уявлення про механізм утворення зображення є спрощеним, бо воно ігнорує вплив дифракції та ряду інших факторів. У роботі з мікроскопом студенти вивчають препарати мікробів зі збільшенням на раз. Найбільше збільшення дає оптичний мікроскоп 3000 разів. Найменший розмір частинок, які можна розглядати в такому мікроскопі, 9

10 дорівнює 0,2 мкм, що з довжиною хвилі видимої частини спектра. Морфологія мікроорганізмів Світ мікроорганізмів включає величезну різноманітність форм, які не становлять єдину систематичну групу. Основними об'єктами мікробіології є бактерії, але крім них мікробіологи вивчають ще дріжджі, гриби, мікроскопічні водорості та деякі найпростіші. На рис. 4 представлені основні групи мікроорганізмів (за винятком найпростіших); співвідношення їх розмірів збережено. Усі живі організми, окрім вірусів, мають клітинну будову. Відповідно до своєї клітинної організації вони поділяються на прокаріотні та еукаріотні. 10

11 Головна відмінність еукаріотів від прокаріотів полягає в наявності вторинних порожнин, що відокремлюють ядро ​​та інші клітинні структури від цитоплазми. Саме поява вторинних порожнин дозволило зробити стрибок в еволюції всього живого світу за рахунок збільшення внутрішньої поверхні мембран еукаріотів. Це дало можливість відповідно до збільшення швидкості дифузії, одночасно здійснювати більшу кількість біохімічних реакцій, що протікають на мембранах. Прокаріотами є бактерії, у тому числі актиноміцети та ціанобактерії. Еукаріот всі рослини, тварини, дріжджі, гриби, найпростіші. Серед прокаріотів в даний час виділяється група архебактерій, яка включає метаногенів, екстремальних галофілів, що живуть у дуже солоній воді, екстремально термофільних бактерій, що окислюють і відновлюють молекулярну сірку, а також термоплазм, позбавлених клітинної стінки. Новий поділ було зроблено на основі порівняння нуклеотидних послідовностей у малих відрізках рибосомних РНК. 11

12 Архебактерії відрізняються за складом клітинних стінок, ліпідів та деяких інших фізіолого-біохімічних особливостей (наприклад, у них інший механізм фіксації СО 2). Таким чином, у будові клітинної організації в даний час виділяють 3 групи: архебактерії (за новою номенклатурою Archaea, археї), еубактерії (за новою номенклатурою Bacteria, бактерії), та еукаріоти (за новою номенклатурою Eukarya). Робота 1. Мікроскопічне вивчення бактерій Морфологія бактерій Теоретичне введення Ця група мікроорганізмів найбільш численна, поширена у природі і має велике промислове значення. Для найменування мікроорганізмів використовують бінарну номенклатуру, як у зоології та ботаніці. Відповідно до цієї номенклатури кожен вид має назву, що складається з двох латинських слів. Перше слово означає рід, а друге вигляд. Родова назва завжди пишеться з великої літери, а видова з малої. Більшість бактерій - одноклітинні організми сферичної, паличкоподібної або звивистої форми. Серед бактерій є невелика кількість нитчастих форм. Бактерії дуже малі, діаметр клітини кулястих бактерій становить 1 2 мкм. Розмножуються бактерії розподілом (за сприятливих умов розподіл відбувається через хв). Деякі бактерії рухливі. Здатність рухатися пов'язана з наявністю особливих органел джгутиків. Найбільш прості формою кулясті бактерії (коки). Вони зустрічаються або у вигляді одиничних кульок, або кульок, зчеплених між собою. За розташуванням клітин після поділу кулясті бактерії поділяють на монококи (поодинокі коки), тетракоки (об'єднані по 4), сарцини (об'єднані по 8), стафілококи (грона), стрептококи (ланцюжки коків). 12

13 Паличкоподібні бактерії є найчисленнішою групою бактерій. Вони мають циліндричну форму клітин з округлими або загостреними кінцями і сильно відрізняються по відношенню до довжини до ширини. Вони можуть бути одиночними або утворюють короткі або довгі ланцюжки. Палички можуть бути різної довжини, зазвичай, кілька мкм, а ширина близько 1 мкм. Деякі паличкоподібні бактерії утворюють усередині клітини особливі тільця суперечки. Кожна клітина утворює одну суперечку, яка слугує для перенесення несприятливих умов. Спору за відповідних умов (температура, вологість, поживні речовини) проростає, перетворюючись на паличку. Стійкість бактеріальних суперечок перевищує стійкість будь-яких живих організмів. Наприклад, споро сенной палички Bacillus subtilis витримує температуру 100 С протягом 3 год. Така стійкість суперечка ускладнює боротьбу з інфекціями. Звивисті мікроорганізми розрізняються за ступенем вигнутості клітин та за кількістю витків. Вони поділяються на вібріони, спірили та спірохети. Якщо у бактерії один неповний завиток спіралі, вона називається вібріоном. Якщо бактерія має кілька спіралеподібних завитків, то її називають спірилою, а мікробів, що мають звивисту форму з великою кількістю дрібних завитків, називають спірохетами. Нитчасті бактерії є нитками, що складаються з циліндричних або дископодібних клітин. Нитки деяких видів укладені в слизову оболонку, яка може бути просякнута гідроксидом заліза або солями марганцю. Процес акумуляції важких металів із розчинів відбувається у клітинах деяких залізобактерій. Великі нитчасті бактерії. Beggiatoa відкладають у клітинах сірку. Нитчасті бактерії живуть зазвичай у морських і прісних водах, зустрічаються також у органічних залишках, що розкладаються, в кишечнику тварин. До ціанобактерій належить велика група організмів, що поєднують прокаріотну будову клітини із здатністю здійснювати фотосинтез. Пігменти клітин ціанобактерій крім хлорофілу а (зеленого кольору) містять фікоціанін пігмент 13

14 синього кольору. За цією ознакою раніше їх називали синьо-зеленими водоростями. Більшість їх багатоклітинні організми, що являють собою довгі, найчастіше нерозгалужені нитки (трихоми). Клітини в нитках об'єднані загальною зовнішньою стіною. Іноді утворюють слизові скупчення «мати». Розмноження здійснюється шляхом розпаду нитки окремі ділянки. Деякі види пересуваються ковзанням (р. Spirulina). Актиноміцети (бактерії, що гілкуються, променисті грибки) велика група прокаріотних мікроорганізмів, яка утворює тонкі розгалужені нитки довжиною в кілька мм і діаметром 0,5 1,5 мкм. Вони є своєрідною групою мікроорганізмів, яка у морфологічному відношенні має схожість із пліснявими грибами (рис. 5). Клітини значної частини представників цієї групи здатні розгалужуватися, що є характерною ознакою грибів. Однак довжина ниток, що гілкуються, актиноміцетів досягає декількох міліметрів, тоді як довжина міцелію грибів декількох сантиметрів. Гіфи грибів зазвичай у кілька разів товщі ниток актиноміцетів. По морфології та розвитку актиноміцети поділяються на вищі та нижчі форми. До вищих відносяться організми з 14

15 розвиненим септованим або несептованим міцелієм та особливими органами спороношення. Суперечки утворюються як ланцюжків на спеціальних спороносящих гіфах повітряного міцелію. Будова органів спороношення по-різному різних видів: довгі чи короткі, прямі чи спіралеподібні (рис. 6). За наявністю міцелію та будовою органів спороношення вищі актиноміцети нагадують міцеліальні гриби. Деякі актиноміцети мають міцелій тільки в молодій культурі, який з віком розпадається з утворенням паличкоподібних та коккоподібних клітин. Нижчі форми актиноміцетів немає справжнього міцелію. Здатність до утворення міцелію виражена вони лише у тенденції клітин до розгалуження. До нижчих актиноміцетів відносяться, наприклад, види роду Mycobacterium, які мають властивість змінювати форму клітин з віком культури (рис. 7). Ця властивість називається плеоморфізм. Серед вищих актиноміцетів чільне місце за чисельністю в природному середовищі займають види роду Streptomyces. Актиноміцети відіграють велику роль у процесах 15

16 ґрунтоутворення та створення родючості ґрунтів. Актиноміцети руйнують складні органічні сполуки (целюлозу, гумус, хітин, лігнін та ін.), недоступні багатьом іншим мікроорганізмам. Майже всі види роду Streptomyces утворюють специфічні продукти життєдіяльності, що мають антибіотичні властивості. Деякі види є збудниками захворювань рослин, тварин та людини. Крім основних форм бактерій існують бактерії, що несуть вирости, що отримали назву простік. (рис.8) 16

17 Функції простек різні. У деяких бактерій вони служать для розмноження, в інших для прикріплення клітини до субстрату. 17

18 18 Практична частина Мета роботи вивчити морфологію представників бактерій Виконуючи першу роботу, студенти навчаються поводженню з мікроскопом, переглядають готові препарати представників бактерій, потім самостійно готують препарати живих бактерій та мікроскопують їх. Спершу студенти мікроскопують готові фіксовані препарати бактерій. Фіксовані препарати є мікроорганізмами, суспендованими у водному середовищі, висушені на предметному склі і пофарбовані аніліновими барвниками. Препарати деяких живих мікроорганізмів студенти готують самостійно. Для цього на чисте предметне скло наноситься невелика крапля водопровідної води, в яку прожареною та остудженою бактеріологічною петлею вноситься невелика кількість досліджуваних мікробів, ретельно розмішується та накривається покривним склом. Надлишок води знімається фільтрувальним папером. Препарат міститься на предметний столик і закріплюється затискачами. Спочатку, дивлячись в окуляр і обертаючи макрогвинт, досягають різкого зображення об'єкта при малому збільшенні з об'єктивом 10х. Потім мікроскоп переводять на велике збільшення з об'єктивом 40х. Обертання гвинтів треба робити з обережністю, тому що при занадто різкому опусканні можна роздавити лінзи об'єктивом. При мікроскопуванні слід на увазі, що мікроскоп, особливо при великих збільшеннях, не захоплює всієї глибини об'єкта, тому при поступовому опусканні тубуса за допомогою мікрогвинта об'єкт видно спочатку зверху, а потім в оптичному розрізі. 1. Перегляд фіксованих препаратів мікроорганізмів. Lactococcus lactis збудник молочнокислого бродіння; форма клітин куляста коки; клітини з'єднані у ланцюжки. Використовується для одержання молочнокислих продуктів.

19 Lactobacillus acidophilum паличкоподібні бактерії; збудник молочнокислого бродіння. Використовується для одержання молочнокислих продуктів. Acetobacter aceti паличкоподібні бактерії, що окислюють етанол в оцтову кислоту. Використовується для одержання харчового оцту. Streptomyces griseus актиноміцет, форма клітини у вигляді тонких розгалужених ниток; продуцент антибіотика стрептоміцину. Saccacharopolyspora erythrae актиноміцет, форма клітини у вигляді тонких розгалужених ниток; продуцент антибіотика еритроміцину. 2. Перегляд живих препаратів Bacillus subtillis – форма клітин у вигляді тонких рухливих паличок; утворює суперечки; продуцент ферментних препаратів Spirulina platensis ціанобактерія; форма клітин у вигляді одиночної нитки, що складається з циліндричних клітин, що щільно прилягають один до одного; має ковзний рух. Застосовується як харчової добавки. Зміст звіту 1. Латинська назва мікроорганізму. 2. Морфологія клітини (дати малюнок із зазначенням збільшення мікроскопа та зберігаючи співвідношення розмірів клітин). 3. Використання досліджуваних бактерій у промисловості. Контрольні питання 1. Опишіть пристрій мікроскопа. 2. Як визначити збільшення мікроскопа? 3. Якою є форма клітин бактерій. 4. Назвіть особливості морфології актиноміцетів. 5. Яких представників бактерій Ви знаєте і яке їхнє практичне значення? Робота 2. Морфологія еукаріотних мікроорганізмів Теоретичне введення 19

20 До еукаріотних мікроорганізмів, які вивчаються мікробіологами, відносяться: гриби, дріжджі, мікроводорості та деякі найпростіші. Морфологія грибів Гриби безхлорофільні мікроорганізми, що мають ниткоподібну форму клітин. Довгі розгалужені нитки, які утворюються ними, називаються гіфами. Гіфи разом утворюють міцелій. За своїми розмірами гіфи грибів набагато більші за актиноміцети. Міцелій у ряду цвілевих грибів розділений перегородками (септований міцелій), інших видів перегородки відсутні. У біотехнології як продуценти в основному використовуються плісняві гриби. Під назвою «цвілеві гриби» об'єднуються деякі представники фікоміцетів, сумчастих та недосконалих грибів. На щільних субстратах плісняві гриби утворюють округлі пухнасті, павутиноподібні, ватоподібні або порошкоподібні колонії зеленого, жовтуватого, чорного або білого кольору. Колонії плісняв складаються з великої кількості гіфів. Більшість гіфів розвивається у повітрі, а частина у товщі субстрату. На гіфах часто утворюються конідієносці, на яких суперечки утворюються або всередині спорангія або у вигляді екзоспор, розташованих ланцюжками. Конідієспори, або конідії, служать для безстатевого розмноження (рис. 10). Конідії, потрапляючи у сприятливі умови, проростають у міцелій. Плісневі гриби дуже поширені в природі і мають потужний ферментативний апарат. Тому є основними деструкторами органічних сполук у природі. Плісневі гриби також широко використовуються в промисловості для одержання органічних кислот, антибіотиків та ферментів. 20

21 Морфологія дріжджів Дріжджі є окремою групою одноклітинних мікроскопічних грибів, що мають велике практичне значення. Дріжджові клітини є великими клітинами округлої чи овальної форми (рис. 11). Деякі дріжджі можуть утворювати рудиментарний міцелій, який називається псевдоміцелій. Розмір клітин коливається від 3 до 10 мкм в довжину і від 2 до 8 мкм в ширину. Більшість дріжджів розмножуються брунькуванням. При цьому на 21

22 поверхні клітини з'являється невелика опуклість нирки (іноді не одна, а кілька), що поступово збільшується в розмірах і, нарешті, відокремлюється від клітини, що виробляє її. Нирка, що відокремилася від материнської клітини, стає новою дріжджовою клітиною. Деякі дріжджі розмножуються поділом. У дрібнозернистому вмісті живих дріжджів (протоплазмі) добре помітні великі вакуолі. Вакуолі є порожнини всередині протоплазми, заповнені клітинним соком. Він складається з розчинених у воді електролітів, білків, вуглеводів та ферментів. У молодих дріжджових клітинах протоплазма гомогенна, але в пізніших стадіях розвитку на протоплазмі з'являються вакуолі, заповнені клітинним соком із продуктами обміну речовин. При виснаженні живильного середовища у багатьох дріжджів настає спороутворення. У деяких видів дріжджів суперечки округлої форми і покриті гладкою оболонкою. У сприятливих умовах суперечки проростають. Дріжджі широко поширені у природі. Вони зустрічаються на винограді, на інших ягодах та фруктах, у молоці, у воді та ґрунті, а також на шкірі людини. Багато дріжджі здійснюють спиртове бродіння та застосовуються для виробництва спирту в хлібопеченні, виноробстві, пивоварінні. 22 Морфологія найпростіших Найпростіші є одноклітинні організми тваринного світу. Серед мікроорганізмів є найбільш складно влаштованими, мають примітивні органи, властиві багатоклітинним тваринам. У деяких з них є ротове та анальне отвори, скорочувальні та травні вакуолі. Розмножуються найпростіші безстатевим (розподілом клітини) та статевим шляхом. Класифікація найпростіших полягає в способах руху. 1. Саркодові. Пересуваються та захоплюють їжу за допомогою псевдоподій, або хибних ніжок. Типовим представником є ​​Amoeba. Розміри амеб не перевищують мкм.

23 2. Джгутикові. Мають щільну плазматичну оболонку та пересуваються за допомогою джгутиків. Ґрунтові форми джгутиків дуже дрібні (2 5 мкм), а водні великі (до 20 мкм). Типовим представником є ​​Euglena. 3. Війскові. Найбільш високоорганізовані найпростіші. Розміри клітин коливаються від 20 до 80 мкм. Типовим представником є ​​інфузорія-туфелька Paramecium, яку культивують на корм малькам риб. 4. Споровики. Нерухомі форми. Багато патогенних, наприклад збудник малярії Plasmodium. Найпростіші поширені у природі. Вони зустрічаються у водоймах, в мулі та ґрунті. Значення найпростіших у природі дуже різноманітне. Вони живуть у шлунково-кишковому тракті різних тварин, беручи участь у перетравленні рослинної їжі, беруть участь у мінералізації органічних залишків у ґрунті, а також є важливою складовою біоценозу в очисних спорудах. Харчуючи бактеріями та завислими речовинами, вони сприяють освітленню води. Найпростіші виконують функцію індикаторів: з розвитку тих чи інших форм можна будувати висновки про якості очищення стоків. Так, переважання амеб та відсутність у складі активного мулу інфузорій свідчить про погану роботу очисних споруд. Інфузорія Tetrahymena широко використовується для первинної оцінки токсичності. Різні види найпростіших представлені на рис. 12. Морфологія водоростей Водорості є великою групою рослинних організмів. Загальна для них наявність хлорофілу і обумовлене цим фотоавтотрофне харчування здатність синтезувати органічні речовини, використовуючи енергію сонячного світла і вуглекислий газ. У багатьох водоростей зелене забарвлення хлорофілу замасковане іншими пігментами. Серед них зустрічаються дуже дрібні одноклітинні та багатоклітинні форми, що відносяться до мікроорганізмів, а також 23

24 багатоклітинні організми, що мешкають у морях і океанах і досягають іноді гігантських розмірів. Об'єктами вивчення мікробіології є деякі водорості мікроскопічних розмірів. Вони мають різноманітну форму і живуть як у суші, і у водному середовищі (рис. 13). 24

25 Практична частина Мета роботи вивчити морфологію представників різних груп еукаріотів. Порядок виконання роботи Студенти самостійно готують живі препарати представників грибів, дріжджів, водоростей та найпростіших; мікроскопують їх з об'єктивом х40 і замальовують із зазначенням збільшення мікроскопа. Плісневі гриби Aspergillus niger - форма клітин у вигляді міцелію з перегородками; на деяких гіфах є нерозгалужені конідієносці зі спорами. Конідіоносці одноклітинні, кулясті здуті, на поверхні здуття розташовані короткі кеглеподібні клітини (стеригми), кожна з яких відшнуровує по ланцюжку конідій, забарвлених у чорний колір. Застосовується для отримання органічних кислот та ферментів. Penicillium chrysogenum гіфи мають перегородки; на деяких гіфах є розгалужені конідієносці зі спорами. Конідії утворюються на кінцях мутовчато розгалужених конідієносців. Застосовується для одержання антибіотика пеніциліну. 25

26 Дріжджі Saccharomyces cerevisiae одиночні дріжджі з овальними та округлими клітинами; розмножуються брунькуванням. Застосовуються у пивоварінні, хлібопеченні, виробництві спирту. У природі зустрічаються на поверхні ягід та інших плодів. Saccharomyces vini форма клітин овальна та округла; розмножуються брунькуванням; після брунькування деякий час не відокремлюються, утворюючи невеликі «гілочки». Застосовуються у виноробстві. Rhodotorula glutinis форма клітин еліптична; клітини поодинокі; розмножуються брунькуванням. Пофарбовані в помаранчевий колір завдяки вмісту каротиноїдів у клітинах. Можуть рости в середовищах з вуглеводнями нафти як джерело вуглецю. Використовуються як кормові дріжджі. Candida tropicalis дріжджі з овальними і сильно витягнутими клітинами, що утворюють псевдоміцелій. Можуть рости в мінеральному середовищі з вуглеводнями як джерело вуглецю. Використовуються як кормові дріжджі. У промисловому масштабі вирощують на відходах виробництва спирту, паперу. Водорості Chlorella vulgaris - мікроскопічна зелена водорість, що має округлі клітини (5 10 мкм у діаметрі); розмножуються автоспорами, які формуються всередині материнської клітини у кількості від 4 до 32 та звільняються після розриву її оболонки. Можуть застосовуватися для масового культивування для одержання кормового білка, а також для регенерації повітря в замкнутих системах (підводні човни, космічні станції тощо). Scenedesmus sp. відноситься до групи зелених водоростей; має овальну форму клітин; зовнішні клітини часто бувають із загостреними кінцями; клітини з'єднані разом чотири. Застосовується для одержання харчового білка. 26

27 Найпростіші Препарат готується з активного мулу аеротенку. Вивчити морфологію виявлених представників найпростіших та замалювати їх. Зміст звіту 4. Латинська назва мікроорганізму. 5. Морфологія клітини (дати малюнок із зазначенням збільшення мікроскопа та зберігаючи співвідношення розмірів клітин). 6. Використання мікроорганізмів, що вивчаються в промисловості. Контрольні питання 1. Опишіть форму клітин представників грибів та їхнє практичне використання. 2. Опишіть форму клітин дріжджів; назвіть представників, і розкажіть про їхнє практичне використання. 3. Розкажіть про морфологію мікроводоростей та їх практичне використання. 4. Назвіть представників найпростіших та розкажіть про їх застосування у біотехнології. Робота 3. Методи вивчення морфології мікроорганізмів Найпоширенішим методом вивчення морфології бактерій є мікроскопування фіксованих препаратів, виготовлених із чистих культур мікроорганізмів або з досліджуваної проби. Дослідження мікроорганізмів у живому стані застосовується щодо великих форм і спостереженні рухливості клітин. Приготування фіксованих препаратів мікроорганізмів Для приготування фіксованих препаратів мікроорганізмів спочатку готують мазок, висушують його, фіксують, а потім фарбують. Мазки готують на чистих предметних стеклах. Знежирювати скла можна етиловим спиртом, сумішшю рівних обсягів спирту та ефіру та іншими 27

28 рідинами. Найпростішим і практично зручним способом знежирення скла є протирання їх з обох боків шматочком господарського мила. Мило видаляють зі скла шматочком сухої вати або серветкою. При виготовленні мазка з колонії бактерій, вирощених на агаризованому середовищі, спочатку наносять на знежирене скло краплю води або фізіологічного розчину. Потім прожарюють бактеріологічну петлю в полум'ї пальника. Після цього, охолодивши петлю на внутрішній стінці пробірки, захоплюють частину колонії без агару петлею. Петлю з культурою вносять у краплю води або фізіологічного розчину на склі і роблять 2 3 кругових рухи. Частина бактерій суспендується у рідині. Надлишок бактерій, що залишилися на петлі, спалюють у полум'ї пальника, нагріваючи петлю до червоного. Потім охолодженою петлею розмазують краплю суспензії по склу. Площа мазка має бути в діаметрі 1,5 2 см. Мазок повинен бути тонким з рівномірним розподілом матеріалу. Якщо мазок готують із культури, вирощеної на рідкому живильному середовищі, то, дотримуючись тих самих правил стерильності, набирають краплю культури петлею або піпеткою і наносять її на середину знежиреного скла. Піпетку із залишком культури занурюють у посудину з дезінфікуючим розчином. Краплю рівномірно розподіляють по склу бактеріологічною петлею. Петлю пропалюють у полум'ї пальника і ставлять у штатив чи склянку. Мазок висушують на повітрі або в струмені теплого повітря, тримаючи його за поздовжні ребра високо над полум'ям пальника. Кордони мазка окреслюють восковим олівцем з зворотного бокускла, а з боку мазка на одному з кінців скла ставлять номер препарату. За цими відмітками легко можна орієнтуватися у місці розташування мазка на склі. Висушений мазок фіксують. Фіксація має такі цілі: 1) вбити мікробів, що робить препарат безпечним при подальшій роботі; 2) прикріпити мікробів до скла, щоб вони не змилися при фарбуванні та промиванні водою; 3) покращити сприйнятливість фарб. 28

29 Найбільш простим, придатним майже для всіх мікробіологічних об'єктів і найпоширенішим у практиці методом є фіксація в полум'ї пальника. Для цього предметне скло проводять 3-4 рази через найбільш гарячу верхню частину полум'я пальника, не допускаючи зайвого перегрівання препарату, щоб не викликати денатурації білка та порушення структури та морфології бактерій. Розрізняють прості та складні диференціальні методи забарвлення. Простим забарвленням користуються для виявлення в досліджуваному матеріалі мікробів, визначення їх кількості, форми та розташування. Просте забарвлення полягає в нанесенні на препарат будь-якої анілінової фарби. Найчастіше для цих цілей використовується фуксин червоне забарвлення, а також лужний розчин метиленової синьки (синька Леффлера) блакитне забарвлення. Техніка фарбування: добре зафіксований препарат поміщають мазком вгору на скляний місток над ванною. На поверхню мазка піпеткою або з крапельниці наносять одну із зазначених фарб. Фуксин витримують на мазку 13 хв, а синьку 35 хв. Фарбу з мазка зливають, препарат промивають водою, висушують на повітрі або обережно промокають фільтрувальним папером. На висушений мазок наносять краплю імерсійної олії, поміщають препарат на предметний столик мікроскопа і мікроскопують з імерсійним об'єктивом (90) у світлі. Диференціальні способи фарбування бактерій. Складні методи фарбування мають велике значення при визначенні та диференціації різних видівбактерій. Вони засновані на особливостях фізико-хімічної будови мікробної клітини та застосовуються для детального вивчення структури клітини та виявлення відмінних ознак по відношенню до деяких барвників. При цих методах мазок забарвлюють кількома фарбами і додатково обробляють протравами або знебарвлюючими речовинами спиртом, кислотою та ін До цих методів відносять найважливіший метод забарвлення для диференціації бактерій забарвлення за Грамом. При цьому методі виявляється 29

30 здатність бактерій утримувати барвник або знебарвлюватись у спирті, що пов'язано з хімічною структурою клітинної стінки. Всі бактерії за будовою клітинної стінки діляться на дві групи: 1) грампозитивні, що фарбуються за Грамом, і 2) грамнегативні, що не фарбуються за Грамом. Відношення до забарвлення за Грамом є настільки важливою диференціальною ознакою бактерій, що обов'язково згадується при їх характеристиці і є таксономічною ознакою. 30 Методика забарвлення за Грамом На фіксований мазок кладуть смужку фільтрувального паперу, заздалегідь просоченого генціанвіолетом. На смужку наносять 3-5 крапель водопровідної води. Через 1-2 хв папірець видаляють пінцетом, а на препарат наливають розчин Люголя. Через 30 с 1 хв зливають розчин Люголя. Наносять кілька крапель 96 Про-ного спирту. Знебарвлюють протягом 1 хв до зникнення сірувато-фіолетових струмків. Препарат промивають водою. На мазок наливають фуксин і витримують 12 хв. Фарбу зливають, препарат промивають водою, висушують фільтрувальним папером. Мікроскопують з імерсійною системою. Грампозитивні бактерії забарвлюються у фіолетово-синій (наприклад, паличка маслянокислого бродіння Clostridium pasteurianum), а грамнегативні – у рожево-червоний колір (кишкова паличка Escherichia сoli). Крім цієї традиційної методики фарбування за Грамом є швидкий і простий метод для диференціації по Граму без фарбування. Клітини бактерій (краще 1 2-добові) поміщають петлею в краплю 3% KOH на предметне скло, розмішують круговими рухами і через 5 8 з петлю різко піднімають. Суспензія грамнегативних бактерій стає в'язкою і тягнеться за петлею, утворюючи слизові оболонки. Грампозитивні бактерії рівномірно розподіляються у краплі лугу (як і воді). Реакція вважається негативною, якщо утворення слизових оболонок не спостерігається протягом 60 с. Збільшення в'язкості викликане лізисом клітинних стінок грамнегативних бактерій у розчині

31 лугу та звільненням ДНК. Метод диференціації бактерій за Грамом без фарбування слід використовувати лише попередньої діагностики, чи підрахунку приблизного співвідношення колоній грампозитивних і грамнегативних бактерій. Число живих і мертвих клітин можна визначити методом забарвлення розчином метиленової сині. Метод заснований на різній проникності живих та мертвих клітин мікроорганізмів. Клітинна проникність у мертвих клітин порушується, тому барвник вільно проходить крізь цитоплазматичну мембрану та адсорбується протоплазмою. Під мікроскопом мертві клітини виглядають синіми, живі безбарвними або блідо-блакитними. Забарвлення здійснюється так: на предметне скло наноситься крапля 2% розчину метиленової сині, покривається покривним склом, надлишок фарби відтягується шматочком фільтрувального паперу. Препарат проглядається під мікроскопом, у 10 полях зору вважають кількість живих та мертвих клітин; число мертвих клітин виражається у %. Приклад: середня кількість живих клітин в одному полі зору 10, середня кількість мертвих клітин в одному полі зору 5, загальна кількість клітин в одному полі зору клітин 100% 5 клітин Х Х 33,3% 15 Таким чином, число мертвих клітин в досліджуваній суспензії мікроорганізмів становило 33,3%. Визначення розмірів клітин Для визначення розмірів клітин мікроорганізмів необхідно мати спеціальний окуляр зі шкалою (окулярний мікрометр) та об'єкт-мікрометр. Окулярний мікрометр, 31

32 найпростішому випадку, є скляний диск з нанесеною на ньому лінійною шкалою, який вкладається в окуляр (рис. 14а). Об'єкт-мікрометр є предметним склом, у центрі якого вигравірувано лінійна шкала довжиною 1 мм, з ціною розподілу 10 мкм. Перед виміром необхідно визначити ціну поділу окулярного мікрометра кожного збільшення мікроскопа. Для цього об'єкт-мікрометр міститься на предметний столик мікроскопа і розглядається як препарат; при цьому одне з видимих ​​поділок об'єкт-мікрометра поєднується з нульовою відміткою шкали окулярного мікрометра і відзначається збіг поділів тієї та іншої шкали (рис. 15). Підраховують, скільки окулярних і об'єктивних поділів посідає цей відрізок, і обчислюють ціну поділів окулярного мікрометра. Якщо після цього помістити на предметний столик препарат мікроорганізмів замість об'єкт-мікрометра та розглядати його 32

33 при тому ж збільшенні, можна виміряти величину мікробної клітини, користуючись шкалою окулярного мікрометра як лінійкою. Для точних вимірювань застосовується спеціальний окулярний мікрометр з нульовою відміткою, що ковзає, пов'язаної з вимірювальним барабаном (рис. 14б). Він дозволяє визначити розміри мікроорганізмів з точністю до десятих часток мікрона. Нульовою відміткою служить подвійна вертикальна лінія, середина якої відповідає перетину двох тонких ліній у вигляді хреста. Перед вимірами необхідно дізнатися ціну розподілу шкали вимірювального барабана. Еталоном служить об'єкт-мікрометр. Обертаючи вимірювальний барабан, нульовою відміткою обводять кілька поділів шкали об'єкт-мікрометра. Подвійна вертикальна лінія показує кількість повних обертів вимірювального барабана. Проводячи вимірювання мікроорганізмів, пересувають нульову позначку вздовж об'єкта і вважають показання вимірювального барабана. Практична частина Мета роботи опанувати основні методи вивчення морфології мікроорганізмів. 33

34 Порядок виконання роботи 1. Приготувати фіксовані препарати молочнокислих бактерій із біокефіру та ацидофіліну. 2. Виконати забарвлення за Грамом клітин Bacillus subtilis (грам+) та Escherichia coli (грам-). 3. Визначити розміри дріжджових клітин Saccharomyces cerevisiae. 4. Визначити кількість живих і мертвих клітин Saccharomyces cerevisiae у суспензії дріжджів. 34 Зміст звіту 1. Морфологія клітин молочнокислих бактерій (малюнки фіксованих препаратів молочнокислих бактерій із зазначенням збільшення мікроскопа). 2. Малюнки фіксованих препаратів грамнегативних та грампозитивних бактерій. 3. Визначення ціни розподілу вимірювального барабана окулярного мікрометра. 4. Розміри дріжджової клітини Saccharomyces cerevisiae. 5. Число живих і мертвих клітин у суспензії дріжджів. Контрольні питання 1. Як приготувати бактерій? 2. З чим пов'язана відмінність бактерій у забарвленні за Грамом? 3. У чому полягає метод забарвлення за Грамом? 4. Як визначити розмір мікроорганізмів? 5. Як визначити кількість живих та мертвих клітин мікроорганізмів методом забарвлення метиленової синю? Тема 2. Культивування мікроорганізмів: принципи упорядкування поживних середовищ; методи стерилізації; методи посівів та пересівання мікроорганізмів. Класифікація та приготування поживних середовищ Культивувати мікроорганізми це означає штучно створювати умови для їхнього зростання. Для культивування

35 мікроорганізмів у лабораторії чи промисловості застосовуються живильні середовища, що містять всі необхідні для життєдіяльності мікроорганізмів речовини. З довкілля поживні речовини надходять у клітину мікроорганізму, та якщо з клітини у середу виводяться продукти обміну. Для життєдіяльності мікроорганізмів необхідні вода, вуглець, кисень, азот, сірка, фосфор, калій, кальцій, магній, залізо та мікроелементи. Всі ці речовини повинні утримуватися в живильному середовищі. Навіть без одного з них зростання або зовсім не буде, або він буде нікчемним. Вуглець, водень, азот, фосфор та сірка називаються біогенними елементами, Оскільки їх частку припадає близько 90 95% сухої маси клітин. Калій, магній, кальцій та натрій називаються макроелементами, або зольними елементами. На частку припадає до 5 10% сухої маси клітин. Залізо, марганець, молібден, кобальт, мідь, ванадій, цинк, нікель та деякі інші катіони важких металів називаються мікроелементами та становлять частки відсотка сухої маси клітин. Найбільше значення будь-якого живого організму має вуглець. Він входить до складу всіх органічних молекул у клітині і на його частку припадає близько 50% сухої біомаси. По відношенню до вуглецю всі організми поділяються на автотрофні та гетеротрофні. Автотрофи як джерело вуглецю використовують вуглекислий газ. Гетеротрофи потребують готових органічних сполук. Джерелом вуглецю для більшості мікроорганізмів можуть бути різні органічні речовини: білки та продукти їх розпаду, вуглеводи, жири, вуглеводні. Азотне харчування за своїм значенням стоїть на другому місці після вуглецевого. Азот входить до складу амінокислот та інших клітинних компонентів, що забезпечують життєздатність організмів. Азот становить 14% сухої речовини клітин. Джерелом азоту служать азотовмісні органічні або мінеральні сполуки. Джерелами мінерального азоту найчастіше є солі амонію та нітрати. Як органічні джерела азоту використовуються білки, амінокислоти, нуклеотиди. Деякі прокаріоти можуть використати атмосферний азот. 35

36 Фосфор та сірка входять до складу важливих біополімерів клітини. Фосфор (3% сухої речовини клітин) входить до складу нуклеотидів та АТФ, а сірка (менше 1%) до складу деяких амінокислот. Як джерело фосфору зазвичай використовують фосфати, а сірки сульфати. Фосфор і сірка можуть використовуватися у вигляді органічних сполук. Для зростання мікроорганізмів потрібні в невеликих кількостях макроелементи: іони лужних металів (Na+, K+) та лужноземельних металів (Mg 2+, Ca 2+), які відіграють важливу роль у життєдіяльності мікроорганізмів. Макроелементи в клітинах мікробів необхідні регулювання проникності, осмотичного тиску, величини рН. Крім цих металів, для зростання мікробів необхідний ряд елементів у кількостях (мікроелементи). Мінеральний склад живильного середовища формує розподіл електричних зарядів лежить на поверхні клітини. Зміна електричного потенціалу клітин може змінити їхню фізіологічну діяльність. Однією з основних функцій мікроелементів є участь у ферментативному каталізі. В даний час дію четвертої частини всіх ферментів у клітині пов'язують із металами. Крім основних компонентів живильного середовища для нормального розвитку деяких мікробів необхідні ще додаткові речовини, які звуться «факторів зростання». Фактори зростання це об'єднана назва різних по хімічної природиз'єднань. Головним чином це органічні речовини, додавання яких у дуже незначних кількостях стимулює зростання та розмноження мікроорганізмів. Вони мають для бактерій те саме значення, що вітаміни для вищих організмів. Ростовими факторами в основному є вітаміни групи В, які відіграють роль регуляторів та стимуляторів обміну речовин у мікробів, або амінокислоти. Як фактори росту використовують дріжджовий автолізат, дріжджовий екстракт, нативні білки (кров, сироватка) та ін. Потреби в джерелах живлення мікроорганізмів дуже різноманітні. З цієї причини не існує універсальної 36

37 середовища, однаково придатною для культивування будь-якого мікроорганізму. Залежно від цілей культивування та потреб даного мікроорганізму поживні середовища розрізняються за трьома ознаками: за складом, фізичним станом та призначенням. За складом живильні середовища поділяються на дві групи: 1) природні (натуральні); 2) штучні (синтетичні). Природними називаються середовища, що мають невизначений хімічний склад, тому що в них входять продукти рослинного або тваринного походження, відходи різних виробництв, які містять органічні сполуки. Природні живильні середовища забезпечують інтенсивне зростання найрізноманітніших мікроорганізмів. Вони містять багатий набір органічних та неорганічних сполук, у тому числі всі необхідні елементи та додаткові речовини. Наприклад, в лабораторних умовах найчастіше використовуються такі живильні середовища. 1. М'ясо-пептонний бульйон (МПБ) екстракт з м'яса, що містить продукти неповного розпаду білка пептони, в яких є органічний вуглець, органічний азот, фосфоровмісні, сірковмісні органічні речовини. У МСЛ містяться також усі необхідні мікроорганізмам мінеральні речовини. МСЛ застосовується при вирощуванні багатьох видів бактерій. 2. Пивне сусло екстракт з пророслих зерен ячменю, що містить як джерело вуглецю цукру (в основному мальтозу), азотисті речовини, зольні елементи, різні ростові фактори та вітаміни групи В. Пивне сусло є гарним середовищем для розвитку багатьох мікроорганізмів, зокрема дріжджів, цвілевих грибів. Хорошими природними середовищами є молоко, картопля, відвари з плодів та овочів. У промисловості зазвичай застосовують напівсинтетичні чи природні середовища. Дуже часто як джерело вуглецю використовують відходи мікробіологічної або харчової промисловості: меляса (відхід цукрового виробництва), 37

Міністерство сільського господарства Російської Федерації ФЕДЕРАЛЬНА АГЕНЦІЯ З РИБОЛІВСТВА КАМЧАТСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ КАФЕДРА БІОЛОГІЇ І ХІМІЇ ХІМІЯ ТА МІКРОБІОЛОГІЯ ВОДИ

Прізвище Шифр ​​Ім'я Робоче місце Район Шифр ​​Разом: Завдання практичного туру регіонального етапу XXXII Всеросійської. Біохімія. ІДЕНТИФІКАЦІЯ ЕКСТРАКТІВ Обладнання: Пробірки (3 пробірки з екстрактами)

Прізвище Шифр ​​Ім'я Район/місто Робоче місце Шифр ​​Разом: ЗАВДАННЯ практичного туру регіонального етапу XXVIII Всеросійської олімпіадишколярів із біології. 2011-12 навч. рік. 11 клас БІОХІМІЯ. Устаткування,

МІКРОБІОЛОГІЯ ПОЯСНЮВАЛЬНА ЗАПИСКА ДО РОБОЧОЇ ПРОГРАМИ КУРСУ «Мікробіологія», 9 клас» на основі авторської програми елективного курсу «Мікробіологія» Аверчинкової О.Є Біологія. Елективні курси. Лікувальне

ЗАВДАННЯ МІКРОБІОЛОГІЯ (мах. 20 балів) Мета роботи: Приготувати та проаналізувати препарати з двох відомих кисломолочних продуктів. Обладнання: Мікроскопи, пальники або спиртовки, предметні стекла,

ЦАРСТВО ПРОКАРІОТИ ПІДЦАРСТВО БАКТЕРІЇ Бактерії належать до прокаріотів. Це найпростіші, найдрібніші та найпоширеніші організми, які існують на землі понад 2 млрд. років, але разом

СИСТЕМУ ОРГАНІЧНОГО СВІТУ Усі організми, що існують на Землі, розділені на чотири царства: Дроб'янки, Гриби, Рослини, Тварини. Дроб'янки відносяться до прокаріотів (доядерних організмів), гриби, рослини,

Тема проекту Дослідження мікроорганізмів, що мешкають у стоячій водоймі Бутівського лісу міста Москви Автор(и): Касаєва Діана, Касаєва Христина, Ткаченко Аліса Школа: ГБОУ ЗОШ 1945 Клас: 5 клас Керівник:

Лабораторна робота «Будування тіл капелюшних грибів» Мета: вивчити будову тіл капелюшкових грибів

ФЕДЕРАЛЬНА ДЕРЖАВНА ОСВІТАЛЬНА УСТАНОВА ВИЩОЇ ПРОФЕСІЙНОЇ ОСВІТИ «ОМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ П.А.СТОЛИПІНА» ІІ

Затверджую Заступник Головного державного санітарного лікаря Російської Федерації - Головний лікар Федерального центру держсанепіднагляду МОЗ Росії Є.Н.БЕЛЯЄВ 20 лютого 2004 р. N 24ФЦ/900 Дата

Дослідницька робота Дріжджі: захоплююче життя маленьких грибів Автор роботи: учень 5 «Б» класу ГБОУ Гімназія 1748 «Вертикаль» Кутайцев Георгій Валерійович Керівник: Носова Олена Володимирівна,

Метод виявлення дріжджів та цвілевих грибів у харчових продуктах МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ Методи виявлення дріжджів та цвілевих грибів у харчових продуктах.: Методичні рекомендації.- М.: Федеральний центр

Тема 4. Бактерії. Гриби. Лишайники. Частина А. 1. Наявність у складі лишайника ціанобактерій забезпечує 1) поглинання атмосферної та ґрунтової вологи 2) використання світла для утворення поживних речовин

БІОЛОГІЯ НАУКА ПРО ЖИВУ ПРИРОДУ Біологія вивчає: ЩО ВИВЧАЄ БІОЛОГІЯ z будова та життєдіяльність живих організмів; z закони індивідуального та історичного розвитку організмів. 3 СИСТЕМА ОРГАНІЧНОГО

1. Нітрифікуючі бактерії відносять до 1) хемотрофів 2) фототрофів 3) сапротрофів 4) гетеротрофів ТЕМА «Фотосинтез» 2. Енергія сонячного світла перетворюється на хімічну енергію в клітинах 1) фототрофів

МІКРОБІОЛОГІЯ ТА ГЕНЕТИКА Завдання 1. Приготувати та проаналізувати препарати з двох відомих кисломолочних продуктів. (мах.10 балів) Обладнання: Мікроскопи, пальники або спиртовки, предметні стекла,

Кваліфікаційні тести за спеціальністю «Бактеріологія» Банк тестових завдань для підготовки до атестації Вибрати одну або кілька правильних відповідей 1. Відповідно до наказу ДКСЕН РФ N обов'язкова

Завдання 3. Одноклітинні та багатоклітинні організми. Царство гриби 1. Що міститься в чорних кульках на кінцях довгих відгалужень гриба мукору? 1) мікроскопічні плоди 2) поживні речовини 3)

ФЕДЕРАЛЬНА ДЕРЖАВНА БЮДЖЕТНА ОСВІТАЛЬНА УСТАНОВА ВИЩОЇ ОСВІТИ «ОРЕНБУРГСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ» Методичні рекомендації для самостійної роботи учнів

Морфологія мікроорганізмів Варіант 1 1. Gracilicutes - це: А. тонкостінкові бактерії Б. товстостінкові бактерії В. бактерії з дефктною клітинною стінкою. Г. бактерії з ніжною клітинною стінкою. 2. До

Завдання для студентів: необхідно вибрати правильні відповіді (може бути від одного до кількох). Морфологія мікроорганізмів Варіант 1 1. Gracilicutes - це: А. тонкостінкові бактерії Б. товстостінкові

Водорості Нижчі рослини Водорості велика і неоднорідна група нижчих рослин. Водорості найчисленніші та одні з найважливіших для планети фотосинтезуючих організмів. Вони зустрічаються

Муніципальна бюджетна загальноосвітня установа Аларська середня загальноосвітня школа «Розглянуто» Керівник МО Протокол від 0 м. «Узгоджено» Заступник директора з УВР МБОУ 0 г «Стверджую»

1 Основні прийоми роботи з мікроорганізмами Завдання 1. Введення в мікробіологію.Техніка безпеки при роботі з мікроорганізмами Мета завдання. Це завдання познайомить вас із правилами безпечної роботи в

Завдання 2. Клітинна будова організмів 1. Який хімічний елемент входить до складу життєво важливих органічних сполук клітини? 1) фтор 2) вуглець 3) мідь 4) калій 2. Як запасна речовина

Плісневі гриби впливають фізичні фактори на зростання і розвиток грибів. Логунов Степан 7г Керівник проекту Буличова М.Б. Актуальність дослідження Суперечки грибів відрізняються високою стійкістю до несприятливих

Тест 5 Варіант 1. Тема "Гриби" Завдання з вибором однієї правильної відповіді. 1. Головна відмінність грибів від рослин полягає в тому, що вони: мають клітинну будову, поглинають із ґрунту воду та мінеральні солі,

1. Пояснювальна записка Програма призначена для вступників до аспірантури ФДБОУ ВПО БДУ за спеціальністю 03.02.03 - Мікробіологія Програма підготовки висококваліфікованих фахівців за напрямом

ПІДРУЧНИКИ ТА НАВЧАЛЬНІ ПОСІБНИКИ ДЛЯ СТУДЕНТІВ

ВИЩИХ НАВЧАЛЬНИХ ЗАКЛАДІВ

В. Н. КИСЛЕНКО

ПРАКТИКУМ

ПО ВЕТЕРИНАРНІЙ

МІКРОБІОЛОГІЇ

І ІМУНОЛОГІЇ

Допущено Міністерством сільського господарства РФ у

як навчальний посібник для студентів вищих

навчальних закладів, які навчаються за фахом

«Ветеринарія»

МОСКВА «Колос» 2005

УДК 619: 579(075.8) ББК 48я73 К44

Редактор Т.С. Мояочаєва
Рецензенти: доктор ветеринарних наук, професор В. І. Плешакова(Інститут вієте

ринарної медицини Омського ДАУ); доктор ветеринарних наук, професор IT. І. Ба

ришників(Інститут ветеринарної медицини Алтайського ДАУ)

Кисленко В. М.

К44 Практикум з ветеринарної мікробіології та імунології. - М.: Колос, 2005. - 232 с. арк.: іл. - (Підручники та навч. посібники для студентів вищ. навч. закладів). ISBN 5-9532-0332-2

Практикум складається із двох розділів. Розділ «Загальна мікробіологія» містить відомості про правила роботи у бактеріологічній лабораторії, опис основних мікробіологічних, генетичних та імунологічних методів вивчення мікроорганізмів. У розділі «Збудники інфекційних хвороб» перераховано методи лабораторної діагностики, диференціації збудників та надано перелік застосовуваних біопрепаратів.

Наведено методичні вказівки щодо проведення практичних занять для викладачів.

Додаються комплекти тестів на електронному носії (CD-диску) за загальною та приватною мікробіологією, імунологією, а також за теоретичним курсом.

Для студентів вищих навчальних закладів за спеціальністю "Ветеринарія".

ВСТУП

Ветеринарні лабораторії – це установи державної ветеринарної служби, діяльність яких спрямована на забезпечення благополуччя у тваринництві, попередження та ліквідацію хвороб та загибелі тварин, а також на охорону населення від хвороб, загальних для тварин та людини. За призначенням ветеринарні лабораторії бувають районні, міжрайонні (зональні), обласні (крайові) та республіканські.

Основне завдання ветеринарних лабораторій – встановлення точного діагнозу хвороб сільськогосподарських тварин, включаючи птахів, хутрових звірів, риб та бджіл, а також проведення експертизи м'яса, молока та інших харчових продуктів тваринного та рослинного походження. У лабораторіях також виконують наукові роботи, здійснюють виробництво деяких біостимуляторів, антибіотиків та ін.

Матеріалом для лабораторних досліджень є кров, сеча, мокротиння, молоко, фекалії, вміст абсцесів (гній), отримані за життя тварини; шматочки паренхіматозних органів або інших тканин після їх загибелі, проби об'єктів довкілля (вода, повітря, грунт, корми, рослини, змив з предметів догляду). Матеріал у лабораторії досліджують бактеріологічними, серологічними, гістологічними, біохімічними, мікологічними та токсикологічними методами, для чого мають бути створені необхідні умови (спеціально відведені приміщення, обладнання, мікроклімат та ін.).

Лабораторія займає окрему будівлю, розташовану далеко від проїжджих доріг. У ній мають бути приймальне відділення, пато-логоанатомічний, бактеріологічний, серологічний, біохімічний та вірусологічний відділи, а також спеціальні приміщення для термостатів, миття посуду, автоклавний. У кімнаті для миття посуду знаходяться столи, раковини, гаряче та холодне водопостачання, газова або електрична плита, стелажі для вимитого посуду, витяжна шафа, емальовані ванни, тази та інші ємності, розчин кислоти у скляних посудинах для знезараження піпеток, предметних шибок та предметного скла. . Окреме приміщення відводять під бактеріологічну кухню (середово-рочна), де готують живильні середовища для культивування мікроорганізмів, готують посуд для стерилізації. Тут же в шафах зберігають стерильний посуд та добре упаковані хімічні речовини, компоненти живильних середовищ

Для виконання роботи в асептичних умовах обладнають спеціальні ізольовані приміщення. бокси(англ. box - коробка), що складаються з власне боксу та передбоксника. Використовують також настільні бокси, предмети та повітря у яких знезаражують лампами УФІ, та ламінарні шафи, де крім цього застосовують активне видалення повітря.

Лабораторних тварин (білих мишей, морських свинок, білих щурів, кроликів та ін.) розміщують у віварії.Як правило, у віварії містять також здорових баранів-донорів, кров яких використовують для реакції зв'язування комплементу (РСК) та приготування живильних середовищ. Заражених лабораторних тварин утримують в ізольованому приміщенні.

Крім того, у будівлі є кімнати для фахівців, обслуговуючого персоналу, кабінет завідувача, бібліотека, вагова, роздягальня, склад та ін.

Щоб підтримувати належну чистоту, підлогу в кімнатах покривають лінолеумом або кахельною плиткою. Стіни та стелі, як правило, гладкі (без карнизів та ліпних прикрас), із закругленими кутами, пофарбовані у світлі тони масляною фарбою. Стелі можна білити вапном. Бажано облицьовувати стіни пластиком або плиткою від підлоги до стелі.

У лабораторії повинні бути гаряча та холодна вода, каналізація, педальні відра для сміття, які щодня звільняють, миють та дезінфікують, рушники, мило та дезінфікуючий розчин. У кімнатах знаходиться тільки необхідне обладнання: столи, шафа для зберігання дрібної апаратури, фарб, реактивів, посуду, інструментів і т. п. Столи зазвичай встановлюють перед вікнами. Вони мають бути стійкими, зручними, висотою 80 см, із закраїнкою. Поверхню столів покривають пластиком чи лінолеумом, склом чи білою спеціальною фарбою. На столі розміщують мікроскоп, також необхідні предмети для бактеріологічної роботи.

Бактеріологічний метод дослідження, як правило, включає мікроскопію, виділення та вивчення властивостей чистої культури збудника хвороби та зараження лабораторних тварин (біологічну пробу). Результати бактеріологічного аналізу за підписом завідувача відділення або директора лабораторії повідомляють лише офіційні особи: ветеринарний лікар, зоо-інженер, керівник підприємства.

Устаткування мікробіологічної лабораторії.

Для роботи в лабораторії необхідні наступні прилади та апарати: біологічні імерсійні мікроскопи з додатковими пристроями (освітлювач, фазово-контрастний пристрій, темнопольний конденсор та ін), люмінесцентні мікроскопи, термостати, апаратура для стерилізації, рН-метри, апарати

отримання дистильованої води (дистилятор), центрифуги, технічні та аналітичні ваги, апаратура для фільтрування (фільтр Зейтца та ін.), водяні лазні, холодильники, апарат для виготовлення ватно-марлевих пробок, набір інструментів (бактеріологічні петлі, шпателі, голки, пінцети та ін), лабораторний посуд (пробірки, колби, чашки Петрі, матраци, флакони, ампули, пастерівські та градуйовані піпетки) та ін.

У лабораторії виділено спеціальне місце для фарбування мікроскопічних препаратів, де знаходяться розчини спеціальних барвників, спирт, кислоти, фільтрувальний папір та інше. Для повсякденної роботи лабораторія повинна мати необхідне поживне середовище, хімічними реактивами, діагностичними препаратами та іншими лабораторними матеріалами У великих лабораторіях є термостатні кімнати для вирощування мікроорганізмів, постановки серологічних реакцій.

Для вирощування, зберігання культур, стерилізації лабораторного посуду та інших цілей призначена така апаратура:

1. 
   Термостат. Апарат, у якому підтримується незмінна температура. Оптимальна температура для розмноження багатьох мікроорганізмів становить 37”С. Термостати бувають повітряними та водяними.
2. 
   Мікроанаеростат. Апарат для вирощування мікроорганізмів у анаеробних умовах.
3. 
   Холодильники Використовують у мікробіологічних лабораторіях для зберігання культур мікроорганізмів, поживних середовищ, крові, сироваток, вакцин та інших біологічних препаратів при температурі близько 4 °С. Для зберігання препаратів нижче 0°С призначені низькотемпературні холодильники, у яких підтримується температура -20°С та нижче.
4. 
   Центрифуги. Застосовують для осадження мікроорганізмів, еритроцитів та інших клітин, поділу неоднорідних рідин (емульсії, суспензії). У лабораторіях використовують центрифуги із різними режимами роботи.
5. 
   Сушильно-стерилізаційна шафа (піч Пастера). Призначений для повітряної стерилізації лабораторного посуду та інших матеріалів.
6. 
   Стерилізатор паровий (автоклав). Призначений для стерилізації парою під тиском. У мікробіологічних лабораторіях використовують автоклави різних моделей (вертикальні, горизонтальні, стаціонарні, переносні).

Правила роботи у мікробіологічній лабораторії.

Мікробіолог має справу з чистими культурами мікроорганізмів, які є потомством однієї клітини. Оскільки в повітрі та на поверхні предметів у лабораторії (на столах, приладах, інструментах, а також на одязі, руках та ін.) завжди присутня безліч різноманітних мікроорганізмів, слід постійно дбати про збереження чистоти культур, що вивчаються. Тому при роботі в мікробіологічній лабораторії необхідно суворо дотримуватись певних правил, одне з яких - підтримання чистоти, включаючи щоденне гігієнічне прибирання всіх приміщень.

Для знищення мікроорганізмів у повітрі та на поверхнях існують різні способи дезінфекції.

Повітря у лабораторії частково очищають провітрюванням. Вентиляція різко знижує чисельність мікроорганізмів у повітрі, особливо при значній різниці температур зовні та всередині приміщення. Тривалість провітрювання щонайменше 30...60 хв.

Більш ефективний і найбільш часто застосовуваний спосіб знезараження повітря - вплив ультрафіолетовим випромінюванням (УФІ), що має високу антимікробну дію і викликає загибель не тільки вегетативних клітин, але і спір мікроорганізмів. Через слабку проникаючу здатність ультрафіолетове випромінювання не проходить через звичайне скло і легко поглинається частинками пилу. Тому для стерилізації час опромінення становить від 30 хв до кількох годин, залежно від ступеня забрудненості повітря.

Як джерело УФІ використовують бактерицидні лампи (УФО). Випромінювачем в них служить електрична дуга, що виникає в парах ртуті низького тиску і що випускає лінійний спектр в ультрафіолетовій ділянці, понад 80% енергії якого припадає на довжину хвилі 2,5 нм.

Бактерицидна лампа є скляною трубкою, вмонтованою між двома електричними контактами і включається в мережу через дросель. Трубка виготовлена ​​із спеціального скла, що пропускає всі промені з довжиною хвилі 2,5 нм і затримує випромінювання із довжиною хвилі коротше 2 нм. Слід пам'ятати, що УФІ викликає гостре запалення рогівки очей з характерною сльозотечею та світлобоязнью невдовзі після опромінення. Тому для того, щоб прямі або відбиті ультрафіолетові промені не впливали на очі, застосовують захисні окуляри. У невеликих приміщеннях при включеній бактерицидній лампі не можна перебувати.

Підлога, стіни та меблі в мікробіологічній лабораторії протирають розчинами різних речовин, що дезінфікують. Обробка пилососом видаляє з предметів пил та значну частину мікрофлори. Як дезінфікуючі розчини найчастіше використовують 0,5...3%-й водний розчин хлораміну. Особливо ретельно слід дезінфікувати поверхню столу, де проводиться робота з мікроорганізмами. Її необхідно протирати дезінфікуючим розчином перед початком роботи, так і після закінчення. На робочому столі неприпустимі зайві предмети. Всі реактиви та розчини повинні бути забезпечені етикетками та стояти на строго визначених місцях. У лабораторії не можна їсти, пити, палити. Працювати слід у халатах.

У лабораторних умовах мікроорганізми вирощують на щільних і рідких живильних середовищах, які розливають у пробірки, колби або чашки Петрі. Посуд та живильні середовища попередньо стерилізують. Внесення клітин мікроорганізмів у стерильне середовище називають посівом, або інокуляцією. Посів (або пересівання) мікроорганізмів вимагає чіткого дотримання певних правил, щоб убезпечити досліджувану культуру від забруднення сторонніми мікроорганізмами.

Посіви мікроорганізмів у стерильні середовища найкраще здійснювати в спеціальних приміщеннях – боксах. Бокс є невеликою ізольованою кімнатою, розділеною перегородкою на дві частини. В основне робоче приміщення боксу входять через тамбур, що має розсувні двері, що унеможливлює різке переміщення повітря і, отже, занесення ззовні сторонньої мікрофлори. Обладнання боксу включає стіл з поверхнею, що легко-миється, стілець, газову або спиртову пальники, бактерицидну лампу, укріплену в спеціальному штативі або змонтовану на стелі боксу. У боксі зручно мати підсобний стіл, де розмішають необхідні під час роботи предмети. Все обладнання боксу, його стіни, підлога і стеля періодично миють і протирають розчинами, що дезінфікують. Перед роботою бокс опромінюють бактерицидною лампою протягом 40...60 хв.

Після посіву пробірки або інші судини, в яких вирощують мікроорганізми, поміщають термостати, де за допомогою терморегуляторів підтримується постійна температура. Посуд із культурами мікроорганізмів, що підлягають утилізації, піддають автоклавуванню, щоб убити клітини, і тільки після цього миють. У посуд із щільними середовищами заливають розчин, що дезінфікує, який через добу видаляють, а посуд миють. Неакуратне поводження з культурами мікроорганізмів призводить до виникнення бактеріального аерозолю, що становить небезпеку здоров'ю співробітників.

Усі співробітники лабораторій, а також кафедр мікробіології, аспіранти, студенти, які приходять на заняття та працюють у науково-студентських гуртках, перш ніж приступити до роботи з заразним матеріалом (культури патогенних мікробів, трупи експериментально заражених тварин, виділення хворих тварин, кров та ін.) ) зобов'язані ознайомитися та суворо дотримуватись наступних правил роботи та техніки безпеки у ветеринарних бактеріологічних лабораторіях:

у приміщення лабораторії входять лише у спеціальному одязі: у халаті, білій шапочці чи косинці. Халат має бути наглухо застебнутий, волосся прибране під шапочку;

до лабораторії не можна проносити сторонні віші, продукти харчування. Портфелі та сумки складають у спеціально виділеному місці;

у приміщенні лабораторії категорично забороняється вживати їжу, пити та палити;

кожному працівнику (студенту) під певним номером виділяють робоче місце, мікроскоп та інше приладдя;

на робочому місці повинно бути обладнання тільки для виконання конкретного завдання. Зазвичай це набір фарб, колба з дистильованою водою, зливна чашка, банки з чистим та відпрацьованим склом, бактеріологічна петля, штатив, банка з дезінфікуючим розчином;

перед початком роботи необхідно перевірити наявність та справність приладів, посуду, газових пальників (спиртувань) та ін. Про помічені недоліки та несправності слід повідомити відповідальному, а на навчальних заняттях – викладачеві;

щоб уникнути вибуху не можна запалювати один спирт (або газовий пальник) від іншого; користуються лише сірниками;

не можна торкатися проводів та контактних частин електромережі металевими та іншими предметами;

студенти без відома викладача чи обслуговуючого персоналу не повинні включати електроприлади та апаратуру;

студенти приступають до виконання завдання лише з дозволу викладача; хід роботи повинен суворо відповідати методиці, що вивчається;

кожен: співробітник та студент повинен дотримуватися охайності в роботі, утримувати в чистоті робоче місце та обладнання;

матеріал, що використовується на навчальних заняттях, вважають особливо небезпечним;

при розпаковуванні матеріалу, надісланого для дослідження, необхідно бути обережними: банки зовні обтирають дезінфікуючим розчином і ставлять тільки на підноси або кювети;

при дослідженні матеріалу, що надійшов і при роботі з бактеріальними культурами дотримуються загальноприйняті в бактеріологічній практиці технічні прийоми, що виключають можливість інфікування працівника;

у процесі вивчення збудників інфекційних хвороб студенти повинні засвоїти особливості правил техніки безпеки під час роботи з конкретними збудниками;

розтин трупів експериментальних (лабораторних) тварин виробляють у спеціальному одязі на обладнаному столі за допомогою необхідних інструментів, використовуючи для цих цілей кювету, залиту воском (або парафіном). Інструменти після розтину на стіл класти забороняється: їх поміщають у склянку з дез-розчином або випалюють над полум'ям пальника;

під час роботи з рідким інфікованим матеріалом використовують гумові балони, з'єднані з піпеткою;

якщо в процесі роботи патологічний матеріал випадково потрапив на стіл, його негайно видаляють тампоном, змоченим розчином, що дезінфікує. При попаданні зараженого матеріалу на шкіру, кон'юнктиву, у ротову порожнину вживають екстрених заходів до знезараження;

після закінчення роботи патологічний матеріал, використані культури мікроорганізмів, інструменти та поверхня столу знезаражують;

наприкінці заняття бактеріальні культури та інший матеріал студенти повинні здати викладачеві, а робоче місце упорядкувати. Виносити із лабораторії пробірки з культурами, препарати (мазки) та інші предмети категорично забороняється;

патологічний матеріал та бактеріальні культури, необхідні для подальшої роботи, залишають на зберігання у закритому рефрижераторі або сейфі;

Перед виходом з лабораторії необхідно зняти халат, руки ретельно вимити і обробити йодованим спиртом. Виходити за межі лабораторії у халатах забороняється;

Дотримання правил роботи та техніки безпеки на навчальних заняттях з мікробіології контролюють чергові. З технікою безпеки під час роботи на кафедрі мікробіології студенти знайомляться на першому занятті, про що розписуються в журналі.

Дотримуючись перелічених правил, співробітник у лабораторії забезпечує стерильність маніпуляцій і попереджає виникнення внутрішньо- та позалабораторного зараження.

Веде лабораторні записи. Зошит для лабораторних робіт є документом, що дозволяє контролювати правильність отриманих даних. До неї мають бути занесені відомості, що стосуються виконання цієї роботи. Запис необхідно вести акуратно, чітко та у певному порядку, наприклад: 1) назву досвіду, дата його постановки та закінчення; 2) об'єкт дослідження; 3) умови проведення досвіду; 4) основний принцип використовуваного методу аналізу; 5) результати досвіду.

Отримані результати докладно описують, цифровий матеріал зводять у таблиці, якщо необхідно, графіки, діаграми, малюнки. Кожна лабораторна робота має закінчуватися власними спостереженнями та висновками, занесеними до робочого зошита.

У процесі роботи студенти опановують техніку та методи мікроскопування, знайомляться з морфологією представників різних груп мікроорганізмів, освоюють підхід до виділення чистих культур та їх ідентифікації, вивчають вплив умов та факторів довкілля на зростання та утворення різноманітних продуктів життєдіяльності мікроорганізмів та знайомляться з деякими методами генетичних дослідженьбактерій.

ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ

ФЕДЕРАЛЬНЕ АГЕНТСТВО З ОСВІТИ

КАРАЧАЄВО-ЧЕРКЕССЬКА ДЕРЖАВНА ТЕХНОЛОГІЧНА АКАДЕМІЯ

Кафедра технології виробництва продуктів тваринництва

МІКРОБІОЛОГІЯ

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

до лабораторних та практичних занять студентам

аграрного інституту

Черкеськ – 2010

Складені на основі зразкової та робочої програмиза курсом «Мікробіологія» відповідно до Державного освітнього стандарту вищої професійної освіти за спеціальністю 110305 «Технологія виробництва та переробки сільськогосподарської продукції» та 110201 «Агрономія» (2000 р.).

Обговорено на засіданні кафедри ТППЗ (протокол від 2.07.2009 р.)

Затверджено методичною комісією Аграрного інституту (протокол №6 від 01.01.2001 р.). Опубліковано за рішенням навчально-методичної ради Карачаєво-Черкеської державної технологічної академії (протокол від 01.01.2001р.)

Укладачі:кандидат біологічних наук, доцент , кандидат сільськогосподарських наук, доцент , помічник

Рецензенти: – кандидат біологічних наук

доцент кафедри «Агрономія»

доцент кафедри «ТППЗ»

Редактор: к. с.-г. наук, доцент
Зміст

Вступ……………………………………………………………………….. 6

1. Мікроскопія……………………………………………………………….. 7

1.1.Світлопольна мікроскопія……………………………………………. .7

1.1.1. Пристрій мікроскопа……………………………………………… 7

2. Робота з мікроорганізмами ………………………………………………. 8

2.1.Методи приготування препаратів…………………………………..... 8

2.1.1.Техніка взяття культури для препаратів…………………………… 8

2.1.2. Дослідження живих клітин мікроорганізмів методом роз-

тискової краплі……………………………………………………….. 8

2.1.3. Фіксовані препарати мікроорганізмів……………………… 9

Освітлювальна система знаходиться під предметним столиком. Дзеркало відображає світло, що падає на нього, в конденсор. Одна сторона дзеркала плоска, інша увігнута. При роботі з конденсором потрібно скористатися плоским дзеркалом. Увігнуте дзеркало застосовують під час роботи без конденсора з об'єктивами малих збільшення. Конденсор складається з 2-3 короткофокусних лінз, збирає промені, що йдуть від дзеркала і спрямовує їх на об'єкт. Конденсор необхідний під час роботи з імерсійними системами. У конденсорі є ірисова (пелюсткова) діафрагма, що складається із сталевих серпоподібних пластинок.

Забарвлені препарати розглядають при майже повністю відкритій діафрагмі, незабарвлені – при зменшеному отворі діафрагми.

Об'єктив– багатолінзова система, від якості якої залежить зображення об'єкта. Зовнішня лінза називається фронтальною, вона забезпечує збільшення. Інші лінзи виконують функції корекції оптичних недоліків.

Об'єктиви бувають сухі та занурені (імерсійні). Працюючи з сухими об'єктивами між фронтальної лінзою об'єктива і об'єктом дослідження перебуває повітря. Працюючи з іммерсійним об'єктивом V=90х між покривним склом і лінзами об'єктива перебуває кедрове масло, показник заломлення якого близький до показника заломлення скла 1,515 і 1,52 відповідно. Об'єктиви мають збільшення 8х, 40х та 90х.

Окулярслужить безпосереднім продовженням «лінз» (кришталиків) очей людини.

Окуляр складається з двох лінз – верхньої – очної та нижньої – збірної, укладених у металеву оправу. Призначення окуляра – збільшення зображення, яке дає об'єктив. Збільшення окуляра вигравірувано з його оправі. Робоче збільшення окулярів не більше від 4х до 15х.

Окуляри бувають різних типів і вибір залежить від об'єктиву. При тривалій роботі з мікроскопом користуються бінокулярною насадкою, оскільки вона покращує видимість об'єкта, знижує яскравість зображення і тим самим зберігає зір.

Робота з мікроорганізмами

2.1. Методи приготування препаратів

2.1.1. Техніка взяття культури для препаратів

Обпаленої в полум'ї бактеріологічною голкою із пробірки беруть невелику кількість мікробної маси. Якщо культура рідка, краще для цього користуватися петлею, в інших випадках - голкою.

2.1.2. Дослідження живих клітин мікроорганізмів методом розчавленої краплі

Досліджують живі клітини мікроорганізмів методом розчавленої краплі, попередньо проводять фарбування об'єкта прижиттєвими барвниками. вітальне забарвлення(барвники: метиленовий синій, нейтральний червоний у концентраціях від 0,001 до 0,0001%).

Препарати мікроскопують, трохи затемняючи поле зору; конденсор трохи опускають, надходження світла регулюють увігнутим дзеркалом. Спочатку користуються малим збільшенням - об'єктив 8х, після того, як виявляють край краплі, встановлюють об'єктив 40х або імерсійний (90х).

У разі використання методу розчавленої краплі на предметне чисте скло наносять краплю водопровідної води. До неї вносять культуру та змішують із водою. Надлишок води видаляють фільтрувальним папером. При використанні імерсійного об'єктива на предметне скло наносять краплю кедрової олії та мікроскопують.

2.1.3. Фіксовані препарати мікроорганізмів

Фіксовані препарати передбачають таку обробку живих клітин, яка дає можливість швидко перервати перебіг життєвих процесів в об'єкті, зберігши його тонку структуру. Внаслідок фіксації клітини міцно прикріплюються до скла і краще фарбуються. Фіксація необхідна у разі роботи з патогенними мікроорганізмами (з метою безпеки).

Приготування мазка.На чисте знежирене предметне скло наносять краплю водопровідної води. Для знежирення скла використовують суміш етилового спирту та сірчаного ефіру у співвідношенні 1:1. Прожареною бактеріологічною голкою з пробірки з культурою беруть невелику кількість мікробної маси та вносять у краплю води. Краплю ретельно розмазують петлею по склу на площі близько 4 см2.

Якщо густа суспензія, її спочатку розводять водою. Для цього прожареною петлею беруть трохи суспензії та переносять у краплю води на інше предметне скло. Суспензію нормальної густоти розмазують тонким шаром по склу, потім сушать мазок на повітрі при кімнатній температурі або при слабкому нагріванні, тримаючи препарат високо над полум'ям пальника. Сильне нагрівання препарату при сушінні не рекомендується для уникнення коагуляції білків, що спотворює структуру та форму клітин. Висушений препарат фіксують.

Фіксація мазка.Її проводять над полум'ям пальникаабо за допомогою хімічних соєднань.У першому випадку препарат три-чотири рази повільно проводять нижньою стороною над полум'ям пальника, у другому випадку використовують хромові сполуки: формалін, осмієву кислоту, ацетон. Один із поширених прийомів фіксації – обробка препарату 96%-ним спиртом або сумішшю рівних обсягів етилового спирту та ефіру (рідина Никифорова). Для цього препарати занурюють на 10-30 хв фіксуючу рідину.

Фарбування препарату.На мазок наносять кілька крапель барвника. Залежно від виду барвника та мети дослідження тривалість фарбування варіює від 1 до 5 хв, в окремих випадках займаючи до 30 хв. Після закінчення фарбування препарат промивають водою, фільтрувальним папером видаляють воду, підсушують на повітрі та мікроскопують.

Існують прості та диференційовані методи забарвлення.

При простийзабарвленні використовують якийсь один барвник (метиленовий синій, фуксин, генціан фіолетовий), фарбується вся клітина.

При диференційованоюзабарвленні окремі структури клітини забарвлюються різними барвниками (забарвлення за Грамом, забарвлення спор).

Дослідження морфології мікроорганізмів

3.1. Форма клітин

3.1.1. Бактерії

За формою всі бактерії ділять на кулясті (коки), паличкоподібні та звивисті.

Кулясті бактерії - коки.

1. Мікрококи –поодинокі кулясті клітини ( Micrococcus agilis).

2. Диплококи –кулясті коки, з'єднані по двоє. ( Azotobacter chroococcum).

3. Тетракоки- кулясті коки, з'єднані по чотири.

4.Стрептококи- кулясті бактерії, з'єднані в ланцюжки (в основному відносяться патогенні, а також молочнокислі бактерії Lactococcus lactis).

5. Сарцини- кулясті бактерії, що групуються по 8 клітин, виникають в результаті поділу клітини в трьох взаємно перпендикулярних площинах. Деякі види сарцинів формують великі кубоподібні пакети, в яких з кожного боку знаходиться по 4 сарцини. Типовий представник Sarcina flava(Сарцина жовта) - найбільш поширений представник мікрофлори повітря.

Усі кулясті форми бактерій, за винятком Streptoctococcus lactis, переглядають на фіксованих та пофарбованих фуксином препаратах.

Паличкоподібні бактерії. До них відносять форми, що не утворюють суперечки. Pseudomonas, Achromobacter, Lactobacillusта ін) та утворюючі суперечки (пологи Bacillus, Clostridiumта ін.).

Неспоротворна паличка Pseudomonas stutzeri – цитоплазма її фарбується рівномірно.

Спороутворюючі палички Bacillus mycoidesі Bacillus mesentericus.Під мікроскопом виглядають нерівномірно забарвленими. Суперечки не забарвлюються, як щільніші структури. Клітини Bacillus mycoidesрозташовуються ланцюжками, це стрептобацили.

Паличкоподібні бактерії переглядають на фіксованих та пофарбованих препаратах.

Звивисті форми

1. Вібріони – злегка вигнуті клітини.

2. Спірили можуть мати один завиток у вигляді російської літери С, два завитки у вигляді латинської літери S або кілька - у вигляді спіралі.

3. Спірохети - довгі та тонкі клітини з великою кількістю завитків; довжина клітин перевищує їхню товщину в 5-200 разів.

Вібріони та спірили зручно переглядати на фіксованому та забарвленому препараті, приготовленому з гноївки, попередньо інкубованої протягом кількох діб у термостаті. З багатьох мікроорганізмів на такому препараті часто зустрічаються звивисті форми.

Зі спірохетами можна познайомитися на фіксованому забарвленому препараті зубного нальоту, особливо вдалі препарати зіскрібка з карієсного зуба. Зубні спірохети дуже тонкі, волосоподібні, короткі (всього 2-3 завитки).

3.1.2. Актиноміцети

Актиноміцети – променисті гриби. Міцелій актиноміцетів на живильних середовищах диференційований: одна частина його занурена в субстрат (субстратний міцелій), інша знаходиться над субстратом (повітряний міцелій).

Багато представників актиноміцетів продукують пігменти, тому їхній повітряний міцелій і особливо колонії пофарбовані в блакитний, синій, фіолетовий, рожевий, бурий, коричневий або чорний кольори. Актиноміцети забарвлюють живильне середовище у відповідні кольори.

На предметне скло наносять шматочок колонії актиноміцету разом із середовищем. Другим предметним склом щільно притискають цей шматочок до скла, роздавлюють та розмазують по склу. Препарат сушать, фіксують, фарбують, проглядають під мікроскопом, де частково проглядаються міцеліальні одноклітинні нитки.

3.1.3. Дріжджі

Дріжджі – одноклітинні мікроскопічні гриби різноманітні за формою: еліпсоподібна, грушоподібна, округла, циліндрична. Розмножуються вегетативним та статевим шляхом.

Для лабораторних занять використовують пекарські дріжджі. Невеликий шматочок дріжджової маси за кілька годин до занять поміщають у теплу підцукровану воду та ставлять у тепле місце. Утворюється білувата каламутна рідина. Краплю цієї рідини наносять на предметне скло, накривають покривним склом, зверху наносять краплю кедрової олії та переглядають препарат з імерсійною системою. Видно клітини, що ниркуються і діляться.

3.2. Хімічні методи дослідження

3.2.1. Забарвлення клітин мікроорганізмів за Грамом

Цей метод диференціації мікробних клітин заснований на відмінності у хімічному складі клітинних оболонок. У клітинах одних видів мікроорганізмів утворюється нерозчинна в спирті сполука йоду з основним барвником, а в інших видів ця сполука з'являється тимчасово і після обробки спиртом розчиняється. Мікроорганізмів першої групи називають грампозитивними другий - грамнегативними.

Техніка фарбування за Грамом.На знежирене предметне скло наносять три тонкі мазки різних культурмікроорганізмів (два з них - контрольні, із свідомо відомим ставленням до забарвлення за Грамом). Мазки висушують на повітрі, фіксують над полум'ям пальника і забарвлюють протягом 1 хв феноловим розчином фіолетового генціану (або кристалічного фіолетового), тримаючи скло в злегка похилому положенні. Потім барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, наносять на нього на 1 хв. розчин Люголя (до повного почорніння мазка). Скло тримають у похилому положенні. Препарат, не промиваючи водою, обробляють, безперервно похитуючи, 96% спиртом протягом 15-20 с. Важливо дотримуватися часу знебарвлення, тому що при перевищенні зазначеного терміну знебарвлюються і грампозитивні клітини.

Промиваючи водою, препарат фарбують фуксином Пфейфера протягом 1 хв. Грампозитивні мікроорганізми набувають темно-фіолетового кольору, а грамнегативні забарвлюються в колір додаткового забарвлення (фуксину).

Результати забарвлення за Грамом залежать від віку культури: у старих культурах мертві клітини завжди забарвлюються грамнегативно. Тому краще використати молоді однодобові культури.

Хорошими об'єктами для фарбування клітин мікроорганізмів за Грамом служать дріжджі, Bacillus mesentericusабо Bacillus subtilis(грампозитивні) та кишкова паличка Escherichia coli (грамнегативна).

Барвники та реактиви для фарбування за Грамом.

1. Феноловий розчин генціану фіолетового:генціан фіолетовий – 1 г, спирт 96%-ний – 10 мл, фенол кристалічний – 2 г, вода дистильована – 100 мл.

У деяких випадках застосовують спиртовий розчин генціануфіолетового:генціан фіолетовий (або кристалічний фіолетовий) – 1 г, спирт 96%-ний (ректифікат) – 100 мл, гліцерин – 5 мл. Суміш ставлять термостат на 24 год, потім фільтрують.

2. Розчин Люголю(йодит калію – 2 г, йод кристалічний – 1 г, вода дистильована – 300 мл). Спочатку готують концентрований розчин йодиту калію в 5 мл води, у ньому розчиняють йод, потім додають воду до 300 мл.

3. Спирт 96%-ний.

4. Фуксин Пфейфера(водний розчин карболового фуксину Цилю): 1 мл карболового фуксину Цилю та 9 мл дистильованої води. Готують його так: 1 г фуксину, 5 г кристалічного фенолу, 96 % спирт – 10 мл, кілька крапель гліцерину, 100 мл дистильованої води, фуксин розчиняють в етанолі, додають розчинений у воді фенол. Розчин перемішують та залишають на кілька днів. Перед використанням фільтрують.

3.2.2. Забарвлення спор у бактерій

Суперечки бактерій порівняно з вегетативними клітинами мають високу стійкість до несприятливих умов зовнішнього середовища. Вони є округлі, овальні або еліпсоподібні утворення. Якщо діаметр суперечки не перевищує діаметра клітини, в якій суперечка утворюється, клітину називають бацилярної, якщо перевищує, то залежно від розташування спори в центрі або на кінці клітини цю клітину називають відповідно клостридіальної або плектридіальної . У бацилярній клітині спору може розміщуватися в центрі клітини - центральнестановище, на кінці - термінальнеі ближче до одного з кінців - субтермінальнестановище.

При спостереженні за живими бактеріями спороутворюючими їх суперечки можна розрізнити по більш сильному заломленню світлових променів. Суперечки кислотостійкі, тому важко офарблюються барвниками. Пояснюється це великою щільністю оболонки, низькою концентрацією у ній вільної води та високим вмістом ліпідів у суперечках. У препаратах, пофарбованих простими способами або за Грамом, суперечки залишаються безбарвними. (Негативне забарвлення).

Всі способи забарвлення спір засновані на єдиному принципіСпершу спори протруюють різними речовинами: хромовою, соляною, сірчаною, оцтовою кислотами, аміаком, їдким натром або перекисом водню, потім забарвлюють клітину зі спорою при нагріванні і, нарешті, знебарвлюють цитоплазму і додатково забарвлюють її контрастним барвником.

Метод Ціля-Нільсена у модифікації Мюллера.До фіксації мазка бактерій на полум'ї готують звичайним способом. Далі на фіксований в полум'ї і остиглий препарат наносять 5% розчин хромової кислоти. Через 5-10 хв її змивають водою. Препарат накривають смужкою фільтрувального паперу та рясно змочують папір карболовим фуксином Цилю. Підігрівають препарат над полум'ям до появи пари (не до кипіння), потім відводять його убік і додають нову порцію барвника. Цю процедуру проводять протягом 7 хв. Важливо, щоб барвник випаровувався, але папір не підсихав. Після охолодження її знімають, препарат промивають водою і ретельно промокають фільтрувальним папером. Внаслідок такої обробки клітини зі спорами рівномірно фарбуються.

Далі знебарвлюють цитоплазму клітин (але не суперечки), обробляючи 1%-ним розчином соляної або сірчаної кислоти протягом 15-30 с. При приготуванні препарату спір Bacillus mycoidesабо Bacillus mesentericusрекомендується знебарвлювати цитоплазму 16-18 с (розмірно рахуючи вголос від 21 до 37-40). При перевищенні цього часу можуть знебарвитися і суперечки. Потім препарат промивають водою і фарбують метиленовим синім 2 хв.

Забарвлення виходить контрастним та яскраво-червоні суперечки чітко виділяються на блакитному тлі цитоплазми.

Метод Пєшкова.На фіксований в полум'ї препарат наливають метиленовий синій Леффлер, доводять його до кипіння і кип'ятять 15-20 с, тримаючи скло над полум'ям. Мазок промивають водою і дофарбовують протягом 30 з 0,5%-ним водним розчином нейтрального червоного. Ще раз промивають, підсушують і далі досліджують препарат з олійною імерсією об'єктива. Суперечки забарвлюються у блакитний чи синій кольори, цитоплазма – у рожевий.

Для дослідження суперечка зручними об'єктами можуть бути Bacillus mesentericusабо Bacillus mycoidesу віці 4 діб.

Реактиви для фарбування суперечок бактерій. 1. Карболовий фуксинЦіля(Див. 3.2.1).

2. Метиленовий синій Леффлер(Див. 3. 2. .1).

3. Насичений водний розчин метиленового синього. 2 г барвника та 100 мл дистильованої води.

4. Хромова кислота, 5%-ний розчин.

5. Соляна(або сірчана кислота, 1% розчин.

4. Культивування мікроорганізмів

4.1. Поживні середовища

4.1.1. Приготування поживних середовищ

М'ясо-пептонний бульйон (МПБ).Для приготування м'ясо-пептонних середовищ використовують м'ясний бульйон,який отримують наступним чином: 500 г дрібно порубаного свіжого м'яса заливають в емальованій каструлі 1 л водопровідної води, нагрітої до 50°З залишають настоюватися 12 год при кімнатній температурі або 1 год при 50-55 °С. М'ясо віджимають, екстракт проціджують через марлю із шаром вати, кип'ятять 30 хв для згортання колоїдних білків і фільтрують двічі (перший раз через марлю з ватою, другий – через паперовий фільтр). Фільтрат доливають водою до 1 л, розливають у колби, закривають ватяними пробками і стерилізують при 120°С 20 хв (корки колб закривають зверху ковпачками з паперу).

М'ясний бульйон може бути використаний у будь-який час для приготування середовищ. Якщо їх готують одразу, то попередня стерилізація м'ясного бульйону не потрібна.

Для приготування МПБ до 1 л м'ясного бульйону додають 5-10 г. пептона(перший продукт гідролізу білка) для підвищення калорійності середовища та 5 г кухонної солідо створення осмотичної активності. Середовище нагрівають до розчинення пептону, постійно помішуючи.

Встановлюють нейтральну або слаболужну реакцію середовища, приливаючи 20%-ний розчин Na2C03 до посиніння вологого червоного лакмусового папірця. Для перевірки рН середовища зручно використовувати індикатор бромтімолблау: 1-2 краплі його змішують у фарфоровій чашці з краплею бульйону. У нейтральному середовищі бромтімолблау – пляшково-зелений, у кислому – жовтий, у лужному – синій.

Після встановлення рН середу знову кип'ятять 5-10 хв, і білки, що згорнулися при зміні реакції середовища, відфільтровують через паперовий фільтр без освітлення бульйону або освітлення його білком. Для цього свіжий яєчний білок збивають з подвійною за об'ємом кількістю води і змішують з бульйоном охолодженим до 50°С. Суміш кип'ятять, помішуючи, на слабкому вогні 10 хв, потім фільтрують. Прозорий м'ясо-пептонний бульйон розливають у пробірки, закривають ватними пробками та стерилізують при 120 °С 20 хв.

М'ясо-пептонний агар (МПА).До 1 л МПБ додають 15-20 г агару. Середовище нагрівають до розчинення агару (температура його плавлення - 100°С, затвердіння - 40°С), встановлюють слаболужну реакцію середовища 20% розчином Na2C03 і через воронку розливають у пробірки (приблизно по 10 мл агару стовпчиком для подальшого розливу по чаші і по 5 мл для отримання скошеного агару - косяків).

При розливі агару краї пробірок повинні залишатися сухими, інакше прилипають пробки до скла. Пробірки з середовищем стерилізують в автоклаві за 120°С 20 хв.

4.2. Методи стерилізації

Стерилізація – це повне знищення клітин мікроорганізмів у живильних середовищах, посуді та ін.

Відомо кілька методів стерилізації. Найчастіше застосовують стерилізацію нагріванням.

4.2.1. Фламбування, або прожарювання

Гартувати можна безпосередньо перед вживанням платинові петлі, голки, шпателі, дрібні металеві предмети (ножиці, ланцети, пінцети), а також скляні палички, предметні, покривні стекла і т.д.

4.2.2. Стерилізація сухим жаром

Її застосовують для обробки посуду та сухих матеріалів, наприклад крохмалю, крейди. При цьому стерилізований об'єкт витримують при 170 ° С протягом 2 годин (з моменту встановлення необхідної температури) в електросушильних шафах. Піднімати температуру вище 170 ° С не рекомендується: ватяні пробки та папір починають руйнуватися.

Перед стерилізацією скляний посуд закривають ватяними пробками та обгортають папером. Чашки, пробірки, піпетки, вату, марлю загортають у папір або поміщають у спеціальні футляри та пенали, в яких стерильний посуд може зберігатися після стерилізації.

Після закінчення стерилізації шафу відкривають тільки після того, як температура знизиться до кімнатної, інакше скло може луснути.

4.2.3. Стерилізація текучою парою

Плинною парою (100 °С) обробляють предмети, що псуються від сухої жару, і деякі живильні середовища, що не витримують вищої температури (середовища з вуглеводами, МПЗ, молоко). Стерилізують у кип'ятильнику Коха по 30 хв протягом 3 діб щодня. Така стерилізація називається дробової.

При одноразовому прогріванні при температурі 100 °С протягом 30 хв гинуть вегетативні клітини, суперечки багатьох мікроорганізмів залишаються життєздатними. Після такого прогріву середу поміщають на 24 год термостат при 28-30 °С. Спори, що збереглися при першому нагріванні, встигають, за цей час прорости у вегетативні форми, які гинуть при нагріванні. Потім цю операцію повторюють ще двічі.

4.2.4. Стерилізація насиченою парою під тиском

Це найбільш швидкий та надійний спосіб стерилізації, при якому гинуть найстійкіші суперечки. З його допомогою стерилізують більшість поживних середовищ, посуд.

Обробку насиченою парою проводять в товстостінному котлі, що герметично закривається. автоклав.На кришці або збоку автоклава знаходяться кран для виходу пари, манометр та запобіжний клапан. Манометр показує, наскільки тиск пари всередині котла вищий за нормальний. Для запобігання вибуху при перевищенні граничного тиску спрацьовує запобіжний клапан, даючи вихід парі.

Показнику манометра у фізичних атмосферах відповідає певна температура.

Надійної стерилізації досягають нагріванням при 120 °З тиском 1 атм протягом 20 хв.

Стерилізацію ведуть в такий спосіб. Наливають воду в автоклав, поміщають в нього предмети, що стерилізуються, загвинчують кришку автоклава і починають підігрів. Кран залишають відкритим доти, доки все повітря, що знаходиться в автоклаві, не буде витіснене парами води. Коли пара почне виходити з крана безперервним струменем, кран закривають, тиск пари в автоклаві доводять до 1 атм і підтримують на цьому рівні 20-30 хв. Потім нагрівання припиняють, чекають, поки стрілка манометра опуститься до 0, обережно (помалу) відкривають кран і спускають пару. Тільки потім відкручують кришку автоклава. Якщо кран відкрити раніше, ніж впаде тиск, то рідина в судинах, що стерилізуються, закипить і виштовхне з них пробки.

Автоклав використовують і для дробової стерилізації плинною парою. У цьому випадку кришку не загвинчують, щоб забезпечити вільний вихід пари.

4.2.5. Пастеризація

Пастеризація є неповною, або частковою, стерилізацією, що означає нагрівання при 65-80°С протягом відповідно 30-10 хв з подальшим швидким охолодженням до 10-11°С. Пастеризують молоко, пиво, вино та інші продукти.

Матеріали та обладнання

МПБ, агар, лакмус червоний, бромтимолблау, порцелянові пластинки з лунками або чашки, скляні палички, 20% розчин Na2C03, пробірки в штативах (для розливу агару), воронки, вата, чашки Петрі, піпетки Мора на 1 мл, папір для обгортання чашок та піпеток, колби ємністю 250 мл, суворі нитки.

5. Облік чисельності та виділення чистої культури мікроорганізмів

5.1. Методи обліку чисельності мікроорганізмів

5.1.1. Облік чисельності мікроорганізмів (КОЕ) у ґрунті методом поживних пластин у поєднанні з методом послідовних розведень

Грунт – найбільш сприятливе середовище для розвитку мікроорганізмів. У зв'язку з великою гетерогенністю її складу для врахування чисельності у ній мікроорганізмів з досліджуваної ділянки беруть середнюґрунтову пробу.

Спочатку готують суспензії (методом розведення), що містять різні концентрації ґрунту в 1 мл води. Для цього на стерильне годинникове скло стерильним фарфоровим шпателем або алюмінієвою чайною ложкою беруть з банки або мішка навішування грунту в 1 г. Годинникове скло, шпатель, ложку фламбують в полум'ї пальника або, змочивши в спирті, обпікають. При зважуванні ґрунту годинникове скло накривають іншим стерильним годинниковим склом.

Наважку ґрунту, дотримуючись умов асептики, переносять у колбу на 250 мл з 99 мл стерильної води. Суміш збовтують 5 хв, не змочуючи пробку. Стерильною піпеткою беруть 1 мл суспензії, що містить 10-2 г ґрунту, і переносять у пробірку з 9 мл стерильної водопровідної води. Піпетку промивають неодноразово водою в пробірці, щоб максимально змити клітини з її стінок. Інший стерильною піпеткою беруть з колби ще 1 мл суспензії і поміщають у другу колбу, що також містить 99 мл стерильної водопровідної води. Цю піпетку промивають так само, як і в першому випадку. Пробірку та другу колбу збовтують 1 хв. Концентрація ґрунту в пробірці буде 10-3 г, у другій колбі -10-4 г. Так само новими стерильними піпетками переносять по 1 мл суспензії з другої колби в другу пробірку з 9 мл і в третю колбу з 99 мл стерильної водопровідної води і готують нові суспензії, що містять в 1 мл відповідно 10-5 та 10-6 г ґрунту.

ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ
Глава I. Мікроскоп та техніка мікроскопіропання
1. Світлооптична мікроскопія
2. Мікроскопія у темному полі
3. Фазово-контрастна мікроскопія
4. Люмінесцентна (флуоресцентна) мікроскопія
Розділ II. Загальні уявлення про культивування, техніку посіву та необхідне обладнання для роботи з мікроорганізмами
Розділ III. Методи приготування препаратів мікроорганізмів
Розділ IV. Дослідження мікробної клітини
1. Форми клітин мікроорганізмів
2. Будова клітин мікроорганізмів (цитохімічні методи дослідження)
3. Забарвлення клітин мікроорганізмів за Грамом
4. Забарвлення спор у бактерій
5. Забарвлення капсул
6. Забарвлення джгутиків
7. Забарвлення ядерної речовини бактерій
8. Забарвлення включень клітин мікроорганізмів
Глава V. Харчування мікроорганізмів
1. Значення окремих поживних елементів
2. Приготування поживних середовищ
3. Методи стерилізації
Розділ VI. Облік чисельності бактерій та виділення чистої культури
1. Облік чисельності бактерій у грунті
2. Визначення якісного складу бактерій
3. Облік чисельності мікроорганізмів у воді та інших рідинах
4. Облік чисельності бактерій у повітрі
5. Виділення чистих культур бактерій
Розділ VII. Визначення виду бактерій
Розділ VIII. Перетворення мікроорганізмами безазотистих органічних речовин
Процеси бродіння
1. Спиртове бродіння
2. Молочнокисле бродіння
3. Маслянокисле бродіння
4. Бродіння пектинових речовин
5. Бродіння целюлози
6. Окислення клітковини
7. Окислення жиру
8. Окислення вуглеводнів
Розділ IX. Перетворення мікроорганізмами органічних та мінеральних сполук азоту
1. Амоніфікація
2. Нітрифікація
3. Денітрифікація (нітратне дихання)
4. Біологічна фіксація атмосферного азоту
Глава X. Перетворення мікроорганізмами сполук сірки, заліза та фосфору
1. Перетворення мікроорганізмами сполук сірки
2. Участь мікроорганізмів у перетворенні заліза
3. Перетворення мікроорганізмами сполук фосфору
СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКА МІКРОБІОЛОГІЯ
Розділ XI. Загальний мікробіологічний аналіз ґрунту
1. Методи досліджень
2. Групи мікроорганізмів, склад та приготування поживних середовищ
3. Взяття середньої ґрунтової проби та підготовка зразка до мікробіологічного аналізу
4. Приготування ґрунтової суспензії
5. Облік різних груп мікроорганізмів
6. Визначення загальної кількості мікроорганізмів у ґрунті методом прямого рахунку під мікроскопом
Розділ XII. Вивчення цінозів мікроорганізмів
1. Метод обростання скла за Н. Г. Холодним
2. Вивчення мікробних цінозів у ґрунті за методом Перфільєва та Габе
3. Метод капілярів Перфільєва у модифікації Арістівської
4. Виявлення мікроорганізмів автохтонної групи, що бере участь у розкладанні гумусових речовин, за методом Виноградського у модифікації Теппер
5. Виявлення мікроорганізмів, що беруть участь у розкладанні гумусових речовин, за методом Тепер
Розділ XIII. Визначення біологічної активності ґрунту
1. Визначення біологічної активності грунту за інтенсивністю розкладання полотна (метод Мішустіна, Вострова та Петрової)
2. Визначення загальної мікробіологічної активності ґрунту щодо виділення вуглекислого газу
3. Визначення амоніфікуючої активності ґрунту
4. Визначення амоніфікуючої активності мікроорганізмів
5. Визначення нітрифікуючої активності ґрунту
6. Визначення денітрифікуючої активності ґрунту
7. Визначення азотфіксуючої активності мікроорганізмів
Розділ XIV. Вивчення бактерій кореневої зони рослин та на коренях
1. Облік бактерій у ризосфері методом Красильникова
2. Облік ризосферної та кореневої мікрофлори методом послідовних відмивань коренів за Е. 3. Теппер
3. Виділення чистих культур бульбочкових бактерій, кількісний облік у ґрунті, визначення їх активності та вірулентності
Розділ XV. Аналіз бактеріальних препаратів
Розділ XVI. Мікробіологія кормів
1. Епіфітна мікрофлора зерна та її зміна при зберіганні корму
2. Аналіз силосу
3. Дріжджування корму
Розділ XVII. Мікрофлора молока та молочних продуктів
1. Бактеріологічний аналіз молока
2. Методи виділення молочнокислих бактерій у чисту культуру
3. Знайомство з мікрофлорою вершкового масла
Покажчик літератури